田亞亞，劉敏軒，楊茜，亢春雨，王向紅*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（保定 071000）

撲草凈是一種抑制植物光合作用的選擇性內(nèi)吸收傳導(dǎo)型的含氮除草劑，用于田地的除草效果很好[1]，卻被一些不法商家用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，用來(lái)清除養(yǎng)殖水體中的水草及有害藻類，導(dǎo)致?lián)洳輧粼谒a(chǎn)品中累積殘留，如魚(yú)、蝦、貝、蟹、海參等水產(chǎn)品，最終可能通過(guò)食物鏈直接損害人類健康[2-3]。

圖1 撲草凈的結(jié)構(gòu)式

目前，中國(guó)對(duì)蔬菜、水果、糧食中撲草凈殘留的測(cè)定方法有明確的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)水、土壤中撲草凈的測(cè)定方法報(bào)道較多，但對(duì)水產(chǎn)品中撲草凈殘留檢測(cè)研究得比較少，故中國(guó)尚無(wú)相對(duì)完善的檢測(cè)水產(chǎn)品中撲草凈殘留量的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，建立水產(chǎn)品中撲草凈殘留量的快速檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫。食品（主要為植物性食品）中撲草凈殘留量的檢測(cè)方法有氣相色譜法（FID檢測(cè)器）[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]，其中分析水產(chǎn)貝類中的撲草凈殘留量的檢測(cè)方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。

試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品——花蛤中撲草凈的殘留量。該方法操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters 1525高效液相色譜儀；SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm×5 μ m）；RE-52 A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（西安安泰儀器有限公司）；KQ-500 DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HJ-2 B恒溫磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；十萬(wàn)分之一電子天平（托利多上海有限公司）；燒杯；量筒；漏斗；容量瓶。

1.2 試劑

撲草凈（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心研制，純度99.9%）；70%甲醇、純甲醇（色譜純，邁瑞達(dá)公司）；二氯甲烷（分析純，天津市進(jìn)豐化工有限公司）；正己烷（色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水硫酸鈉（化學(xué)純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；C18小柱（500 mg/3 mL）；氨基小柱（500 mg/3 mL）；石墨化碳黑小柱（500 mg/3 mL）；氧化鋁（酸性）小柱（500 mg/3 mL）；PSA小柱（N-丙基乙二氨鍵合硅膠固相萃取小柱，500 mg/3 mL）。

1.3 色譜條件

色譜柱，SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm×5 μ m）；流動(dòng)相，甲醇-水（70︰30，V/V）；紫外波長(zhǎng)230 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.4 溶液配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取50 mg撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.4.2 供試品溶液的配制（樣品前處理）

提?。悍Q取10 g已粉碎均質(zhì)的樣品于燒杯中，每次加入30 mL丙酮，于振蕩器上振蕩10 min，靜置分層后，收集濾液于錐形瓶中，重復(fù)3次。在濾液中加入5 g氯化鈉，振蕩15 min，靜置分層，棄去水層，丙酮層過(guò)無(wú)水硫酸鈉后，收集于燒杯中，用10 mL的丙酮洗滌錐形瓶，過(guò)濾到燒杯中，用氮吹濃縮儀于50 ℃濃縮至干，加3 mL丙酮溶解殘?jiān)?/p>

凈化：取固相萃取小柱，加入1柱管體積的正己烷對(duì)小柱活化。加入3 mL的樣品處理液，并用2 mL×2的丙酮洗滌雞心瓶，并將洗滌液轉(zhuǎn)移到小柱中。用2 mL×2的二氯甲烷洗脫，收集洗脫液。

濃縮：收集洗脫液于燒杯中，用氮吹濃縮儀于40℃濃縮至干，用1 mL的甲醇定容。過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供液相分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相配比的選擇

考察甲醇-水90︰10，80︰20和70︰30（V/V）3種配比的混合溶液為流動(dòng)相，其他色譜條件相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水90︰10時(shí)，撲草凈保留時(shí)間為2.67 min，出峰時(shí)間太早，易受到其他雜質(zhì)的干擾。當(dāng)甲醇-水80︰20時(shí)，保留時(shí)間為4.08 min，分離效果不明顯，峰形不好。當(dāng)甲醇-水70︰30時(shí)，保留時(shí)間為7.94 min，分離效果、洗脫效果都很好，且色譜峰形好。故選擇甲醇-水70︰30（V/V）作為流動(dòng)相。撲草凈標(biāo)樣液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 撲草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖

2.2 萃取條件的選擇

2.2.1 固相萃取小柱的選擇

花蛤中含有大量的蛋白、脂肪、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，故在進(jìn)行液相分析前需有效地去除這些雜質(zhì)[10]。固相萃取作為最常用的樣品凈化方法之一，可滿足液相對(duì)樣品前處理的要求。試驗(yàn)選用PSA柱（N-丙基乙二氨鍵合硅膠固相萃取小柱）、C18柱、石墨化碳黑柱、氨基柱、氧化鋁（酸性）柱5種不同固相萃取小柱進(jìn)行試驗(yàn)。

以花蛤?yàn)闃悠?，在撲草凈添加濃?.05 mg/kg條件下，比較不同固相萃取小柱的萃取效果。由圖3可以看出，經(jīng)PSA固相萃取小柱萃取后，得到的峰面積最大，說(shuō)明PSA小柱中的吸附劑N-丙基乙二氨對(duì)撲草凈的吸附能力很強(qiáng)。同時(shí)由表1中不同萃取小柱對(duì)回收率的影響也能得出由PSA小柱處理后得到的回收率為86.54%～89.21%，是5種不同萃取小柱中得到回收率最高的。PSA柱屬于弱陰離子交換柱，吸附機(jī)制之一為極性作用和螯合作用[11]，故能很好地將撲草凈吸附在表面。操作方法較為簡(jiǎn)單，能達(dá)到較好的凈化效果，故選擇PSA固相萃取小柱作為固相萃取的凈化柱。

圖3 不同固相萃取小柱對(duì)峰面積的影響

表1 不同固相萃取小柱對(duì)回收率的影響（N=6）

2.2.2 洗脫劑的選擇

試驗(yàn)比較丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈對(duì)撲草凈的洗脫效果。撲草凈添加濃度0.05 mg/kg，使用PSA柱為萃取柱條件下，經(jīng)萃取后，分別以這5種溶劑進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液的峰面積。從圖4可以看出，正己烷的洗脫效果最好。由表2同樣可以得出，經(jīng)正己烷洗脫后，回收率最高達(dá)94.58%，洗脫劑采用甲醇、乙腈時(shí)，回收率均小于60%。洗脫劑采用正己烷溶液時(shí)，由于其極性大于提取液，可將結(jié)合在PSA柱上的撲草凈直接洗脫，操作簡(jiǎn)單，凈化效果好。

圖4 不同洗脫劑對(duì)峰面積的影響

表2 不同洗脫劑對(duì)回收率的影響（N=6）

圖5 空白花蛤樣品的液相色譜圖

圖6 加標(biāo)花蛤樣品的液相色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系

用甲醇稀釋配置撲草凈含量分別為1，10，40，80，100，200，600和1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得撲草凈的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=6.3×104x+1.46×106，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 1。

圖7 撲草凈的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 回收率、精密度與檢出限

由表3可以得出，在0.025～0.100 mg/kg范圍內(nèi)，撲草凈回收率為76.13%～85.57%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（N=6）為2.45%～7.74%。以基線噪聲3倍峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定撲草凈的檢出限，得出撲草凈檢出限為0.3 μg/kg。

表3 花蛤樣品中撲草凈的添加回收率與精密度（N=6）

3 結(jié)論

建立一種采用高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品——花蛤中撲草凈殘留量的分析方法。該方法對(duì)樣品的前處理較為簡(jiǎn)單且凈化結(jié)果良好，故可推廣使用。結(jié)果表明，該方法的檢出限為0.3 μg/kg，在0.025～0.100 mg/kg濃度范圍內(nèi)，撲草凈回收率最高可達(dá)85.57%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、方法的回收率均能滿足農(nóng)藥殘留分析要求，故可保證檢測(cè)分析數(shù)據(jù)的可靠性，是一種較為理想的快速檢測(cè)方法。