胡寶玲，于桂芳，郭小莉，胡軍華，王婧，蕭偉*

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222001）

緩解視疲勞片是由肉蓯蓉、枸杞、菊花、葛根、葉黃素及輔料經(jīng)加工制成的具有緩解視疲勞作用的保健食品，葉黃素為其主要有效成分。葉黃素是從萬壽菊花瓣和玉米中提取而來的一種類胡蘿卜素，被廣泛應(yīng)用于眼科疾病的保健食品中[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，葉黃素有多種幾何異構(gòu)體，經(jīng)光碘化全反應(yīng)主要產(chǎn)生6種順式異構(gòu)體[2]，但在自然界中順式葉黃素含量極低，其生物活性也很低[3]；另外，從植物中提取的葉黃素和玉米黃素是共存的，它們互為同分異構(gòu)體[4]，很難將2種物質(zhì)完全分離。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的葉黃素常用的檢測方法有紫外分光光度法[5-6]、HPLC-UV法[7-10]、HPLC-MS法[3-11]。紫外分光光度法測定的結(jié)果是總類胡蘿卜素含量，包括全反式葉黃素、多個(gè)順式葉黃素及玉米黃素；HPLC-UV法，大多采用C18色譜柱[12-14]，不能將葉黃素的幾何異構(gòu)體分開?；莶Φ萚8]使用C30色譜柱將葉黃素和玉米黃素分開，但只是定性分析，未能將全反式葉黃素進(jìn)行定量。李寧等[10]使用C30色譜柱將葉黃素和玉米黃素分別進(jìn)行定量，但供試品的前處理較繁瑣；HPLC-MS法雖然能將全反式葉黃素和順式異構(gòu)體分開，但是質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，成本較高，不具有普適性。目前，關(guān)于保健食品中葉黃素的測定方法多采用國標(biāo)[15]，國標(biāo)中供試品的處理針對的是食品和乳制品，不適用于微囊包合類產(chǎn)品的含量測定，而且國標(biāo)在結(jié)果處理方面將全反式和順式葉黃素之和計(jì)算葉黃素含量，不能真實(shí)反映產(chǎn)品質(zhì)量。因此，建立一個(gè)快速高效測定全反式葉黃素的方法非常必要。

針對研發(fā)的保健食品的特點(diǎn)，開發(fā)一種操作簡便、能夠很好地分離葉黃素幾何異構(gòu)體和同分異構(gòu)體、結(jié)果處理簡單的方法，并進(jìn)行系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法分離度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、靈敏度均符合要求。該方法可為監(jiān)管緩解視疲勞類產(chǎn)品中葉黃素的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備

液相色譜儀（SHIMADZU-20AT）；電子天平（METTLER TOLEDO XP6，METTLER TOLEDO MS-105Du，METTLER TOLEDO AL204）；數(shù)控超聲清洗器（KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司）；臺式離心機(jī)（TG16MW，湖南赫西儀器裝備有限公司）；超純水機(jī)（Milli-Q Academic，美國MiLLipore）。

1.2 試劑

3批保健品緩解視疲勞片樣品（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司在研品種，由硬脂酸鎂、交聯(lián)纖維素鈉、葉黃素、肉蓯蓉、枸杞、菊花、葛根經(jīng)加工制成的具有緩解視疲勞作用的保健食品，分別為20180901批、20180902批和20180903批）；葉黃素對照品（純度85.6%，LOT LRAB3708批，Sigma公司）；甲醇（色譜純，LOT 17070505批，TEDIA）；二丁基羥基甲苯（化學(xué)純，20171011批，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲基叔丁基醚（色譜純，LOT 095170批，MREDA）；N, N-二甲基甲酰胺（色譜純，LOT LS30R61批，北京百靈威科技有限公司）；乙醇（色譜純，LOT 017112批，MREDA）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用YMC Carotenoid C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以甲醇/水（88︰12，V/V）為流動相A相，以甲基叔丁基醚為B相，2項(xiàng)均含有0.1%BHT，梯度洗脫；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長445 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取5.512 mg對照品，精密稱定于100 mL棕色量瓶中，用0.1% BHT的乙醇溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，即得儲備液。分別精密移取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mL儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT的乙醇溶液定容，稀釋成質(zhì)量濃度為0.94，1.89，3.77，5.66，7.55和9.44 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品，除去薄膜衣片，研細(xì)，取300 mg粉末，精密稱定，置于100 mL棕色量瓶中，加入5 mL水，超聲分散20 min，加0.1% BHT的乙醇溶液至接近刻度，超聲5 min，用0.1% BHT的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，離心，即得。

2.4 專屬性考察

陰性供試品溶液的制備：取300 mg不含葉黃素的本品粉末，按照2.3小節(jié)制備陰性供試品溶液，分別吸取陰性供試品溶液、供試品溶液和對照品溶液，各20 μL注入高效液相色譜儀，由圖1可以看出，供試品色譜中呈現(xiàn)與對照品色譜主峰保留時(shí)間一致的色譜峰，陰性供試品色譜圖中在待測成分保留時(shí)間處無雜質(zhì)峰出現(xiàn)，表明此方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

取2.2小節(jié)的系列濃度，平行進(jìn)樣2針，以色譜峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出線性方程y=285 403x-560.6（r=0.999 9），全反式葉黃素在0.94～9.44 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 檢出限

取線性用低濃度對照品溶液逐級稀釋，以信噪比S/N=3相應(yīng)值為檢出限，以取樣量300 mg，定容體積100 mL計(jì)算，全反式葉黃素檢出限為9.1×10-6mg·kg-1。

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.2小節(jié)的5.66 μg·mL-1含全反式葉黃素的對照品溶液及2.3小節(jié)的供試品溶液，按照2.1小節(jié)的色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，計(jì)算RSD，對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.62%和0.52%。RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

圖1 保健食品緩解視疲勞片的HPLC圖

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取同一對照品溶液和同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，6，9，12，15，22，23和24 h按照2.1小節(jié)的色譜條件各進(jìn)樣1次，測得全反式葉黃素峰面積，計(jì)算RSD。對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.98%和0.51%，均小于2%，表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（20180901批），按照2.3小節(jié)平行制得6份供試品溶液，按照2.1小節(jié)的色譜條件測定，計(jì)算全反式葉黃素的含量及RSD值。結(jié)果表明，全反式葉黃素含量為2.04 mg·g-1，RSD為1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1 0 回收率試驗(yàn)

取7.964 mg對照品（純度0.856%），精密稱定于25 mL棕色量瓶中，用0.1% BHT的乙醇溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.272 7 mg·mL-1的加標(biāo)溶液。

取150 mg（樣品中葉黃素含量為0.002 04 mg·kg-1）本品（20180901批），精密稱定于100 mL棕色容量瓶中，分別加入0.5，1.0和1.5 mL對照品溶液，按照2.3小節(jié)分別制備低（0.5︰1）、中（1.0︰1）、高濃度（1.5︰1）的加樣供試品溶液，每種濃度分別制備3份平行樣，共9份。按照2.1小節(jié)的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。全反式葉黃素的平均回收率為100.48%，RSD為1.59%。平均回收率均為95%～105%，RSD小于2%，說明方法準(zhǔn)確性較好。

表1 全反式葉黃素的加樣回收率試驗(yàn)（N=9）

2.1 1 樣品含量測定

取3批緩解視疲勞片樣品（批號分別為20180901，20180902和20180903），按照2.3小節(jié)制備供試品溶液，按照2.1小節(jié)的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。計(jì)算全反式葉黃素的理論含量為1.9 mg·kg-1，由表2可知實(shí)測值與理論值較為接近。

表2 3批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

通過查閱文獻(xiàn)，C30為固定相色譜柱分離類胡蘿卜素的幾何異構(gòu)體具有明顯的優(yōu)勢[16]。因此選擇Reprospher C30-DE（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch ultimate? XB-C30（4.6 mm×250 mm，5 μ m）、YMC Carotenoid C30（4.6 mm×250 mm，5 μ m）3種不同品牌的C30色譜柱作為考察對象。結(jié)果表明，使用Reprospher C30色譜柱，全反式葉黃素和玉米黃質(zhì)合并為1個(gè)峰，無法將2種物質(zhì)分離；使用Welch ultimate?XB-C30色譜柱，全反式葉黃素和玉米黃素未達(dá)到基線分離；使用YMC Carotenoid-C30色譜柱，全反式葉黃素和玉米黃素達(dá)到基線分離，峰型好，所以選擇YMC Carotenoid-C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

3.2 流動相的選擇

對乙腈-甲基叔丁基醚、乙腈-甲醇-甲基叔丁基醚、甲醇-水-甲基叔丁基醚分別進(jìn)行考察，確定甲醇-水-甲基叔丁基醚為流動相，為使全反式葉黃素與雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，降低B相甲基叔丁基醚的比例，發(fā)現(xiàn)隨著甲基叔丁基醚比例降低，全反式葉黃素出峰時(shí)間延長，全反式葉黃素與雜質(zhì)分離效果越好，但是降低到一定程度，全反式葉黃素出峰時(shí)間太長，峰型較寬。通過對比例的摸索，確定流動相0～30 min，B 0%～50%；30.0～30.1 min，B 50%～0%；30.1～40.0 min，B 0%。在此條件下，全反式葉黃素、順式葉黃素及玉米黃素均可得到基線分離。

3.3 破囊溶劑的選擇

為增加葉黃素在制劑中的穩(wěn)定性，葉黃素往往以微囊包合物的形式加入到產(chǎn)品中[17]，對于供試品的制備方法，需先進(jìn)行破囊處理，由于囊材是由玉米淀粉和辛烯基琥珀酸淀粉鈉包合成微囊，因此選擇對微囊具有一定溶解性的溶劑先進(jìn)行破囊處理。分別考察水、N, N-二甲基甲酰胺、無水乙醇不同破膜溶劑，發(fā)現(xiàn)N, N-二甲基甲酰胺和水對全反式葉黃素含量無顯著性差別，但是水經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，最終確定水作為破囊溶劑。

3.4 指標(biāo)選擇

國家標(biāo)準(zhǔn)以全反式及順式葉黃素之和計(jì)算葉黃素的含量，原因是食品中未經(jīng)包合的葉黃素容易受外界環(huán)境的影響轉(zhuǎn)變成順式，但葉黃素經(jīng)微囊包合后穩(wěn)定性提高。研發(fā)的產(chǎn)品經(jīng)影響因素考察（高溫60 ℃、高濕90%、強(qiáng)光），5和10 d的葉黃素含量均無明顯變化，確實(shí)說明該產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好，且順式異構(gòu)體中含量最高的占全反式比例的1.5%，順式異構(gòu)體總和約占全反式比例的4.5%，含量較低。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，順式葉黃素生物活性低[3]，決定產(chǎn)品質(zhì)量的成分為全反式葉黃素。因此選擇含量高、穩(wěn)定性好、生物活性高的全反式葉黃素進(jìn)行定量。

3.5 對照品濃度的校準(zhǔn)

國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定對照品的純度為98%，但經(jīng)文獻(xiàn)研究，葉黃素中總會混有3%～6%的玉米黃素，二者為同分異構(gòu)體[18]，分離十分困難，試驗(yàn)采用Sigma公司的對照品，經(jīng)GC-MS聯(lián)用測得全反式葉黃素純度為85.6%，這與采用HPLC-UV測得的結(jié)果一致，全反式葉黃素在24 h內(nèi)穩(wěn)定存在，因此無需對對照品濃度進(jìn)行校正。

4 結(jié)論

采用YMC Carotenoid-C30色譜柱能夠?qū)⑷词饺~黃素和玉米黃素分開，且能對全反式葉黃素準(zhǔn)確定量。經(jīng)過系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法專屬性、精密度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性等均符合要求。該方法供試品處理操作簡便，結(jié)果計(jì)算簡單，適用于緩解視疲勞類產(chǎn)品中全反式葉黃素的含量測定，為該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。