胡寶玲，于桂芳，郭小莉，胡軍華，王婧，蕭偉*

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222001）

緩解視疲勞片是由肉蓯蓉、枸杞、菊花、葛根、葉黃素及輔料經(jīng)加工制成的具有緩解視疲勞作用的保健食品，葉黃素為其主要有效成分。葉黃素是從萬壽菊花瓣和玉米中提取而來的一種類胡蘿卜素，被廣泛應用于眼科疾病的保健食品中[1]。有文獻報道，葉黃素有多種幾何異構體，經(jīng)光碘化全反應主要產(chǎn)生6種順式異構體[2]，但在自然界中順式葉黃素含量極低，其生物活性也很低[3]；另外，從植物中提取的葉黃素和玉米黃素是共存的，它們互為同分異構體[4]，很難將2種物質完全分離。目前國內(nèi)外文獻報導的葉黃素常用的檢測方法有紫外分光光度法[5-6]、HPLC-UV法[7-10]、HPLC-MS法[3-11]。紫外分光光度法測定的結果是總類胡蘿卜素含量，包括全反式葉黃素、多個順式葉黃素及玉米黃素；HPLC-UV法，大多采用C18色譜柱[12-14]，不能將葉黃素的幾何異構體分開?；莶Φ萚8]使用C30色譜柱將葉黃素和玉米黃素分開，但只是定性分析，未能將全反式葉黃素進行定量。李寧等[10]使用C30色譜柱將葉黃素和玉米黃素分別進行定量，但供試品的前處理較繁瑣；HPLC-MS法雖然能將全反式葉黃素和順式異構體分開，但是質譜儀價格昂貴，成本較高，不具有普適性。目前，關于保健食品中葉黃素的測定方法多采用國標[15]，國標中供試品的處理針對的是食品和乳制品，不適用于微囊包合類產(chǎn)品的含量測定，而且國標在結果處理方面將全反式和順式葉黃素之和計算葉黃素含量，不能真實反映產(chǎn)品質量。因此，建立一個快速高效測定全反式葉黃素的方法非常必要。

針對研發(fā)的保健食品的特點，開發(fā)一種操作簡便、能夠很好地分離葉黃素幾何異構體和同分異構體、結果處理簡單的方法，并進行系統(tǒng)方法學驗證，該方法分離度、準確性、重復性、靈敏度均符合要求。該方法可為監(jiān)管緩解視疲勞類產(chǎn)品中葉黃素的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器設備

液相色譜儀（SHIMADZU-20AT）；電子天平（METTLER TOLEDO XP6，METTLER TOLEDO MS-105Du，METTLER TOLEDO AL204）；數(shù)控超聲清洗器（KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司）；臺式離心機（TG16MW，湖南赫西儀器裝備有限公司）；超純水機（Milli-Q Academic，美國MiLLipore）。

1.2 試劑

3批保健品緩解視疲勞片樣品（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司在研品種，由硬脂酸鎂、交聯(lián)纖維素鈉、葉黃素、肉蓯蓉、枸杞、菊花、葛根經(jīng)加工制成的具有緩解視疲勞作用的保健食品，分別為20180901批、20180902批和20180903批）；葉黃素對照品（純度85.6%，LOT LRAB3708批，Sigma公司）；甲醇（色譜純，LOT 17070505批，TEDIA）；二丁基羥基甲苯（化學純，20171011批，國藥集團化學試劑有限公司）；甲基叔丁基醚（色譜純，LOT 095170批，MREDA）；N, N-二甲基甲酰胺（色譜純，LOT LS30R61批，北京百靈威科技有限公司）；乙醇（色譜純，LOT 017112批，MREDA）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用YMC Carotenoid C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以甲醇/水（88︰12，V/V）為流動相A相，以甲基叔丁基醚為B相，2項均含有0.1%BHT，梯度洗脫；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長445 nm；進樣體積20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取5.512 mg對照品，精密稱定于100 mL棕色量瓶中，用0.1% BHT的乙醇溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，即得儲備液。分別精密移取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mL儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT的乙醇溶液定容，稀釋成質量濃度為0.94，1.89，3.77，5.66，7.55和9.44 μg·mL-1的系列標準溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品，除去薄膜衣片，研細，取300 mg粉末，精密稱定，置于100 mL棕色量瓶中，加入5 mL水，超聲分散20 min，加0.1% BHT的乙醇溶液至接近刻度，超聲5 min，用0.1% BHT的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，離心，即得。

2.4 專屬性考察

陰性供試品溶液的制備：取300 mg不含葉黃素的本品粉末，按照2.3小節(jié)制備陰性供試品溶液，分別吸取陰性供試品溶液、供試品溶液和對照品溶液，各20 μL注入高效液相色譜儀，由圖1可以看出，供試品色譜中呈現(xiàn)與對照品色譜主峰保留時間一致的色譜峰，陰性供試品色譜圖中在待測成分保留時間處無雜質峰出現(xiàn)，表明此方法專屬性良好。

2.5 線性關系考察

取2.2小節(jié)的系列濃度，平行進樣2針，以色譜峰面積的平均值為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得出線性方程y=285 403x-560.6（r=0.999 9），全反式葉黃素在0.94～9.44 μg·mL-1質量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.6 檢出限

取線性用低濃度對照品溶液逐級稀釋，以信噪比S/N=3相應值為檢出限，以取樣量300 mg，定容體積100 mL計算，全反式葉黃素檢出限為9.1×10-6mg·kg-1。

2.7 精密度試驗

取2.2小節(jié)的5.66 μg·mL-1含全反式葉黃素的對照品溶液及2.3小節(jié)的供試品溶液，按照2.1小節(jié)的色譜條件分別連續(xù)進樣6次，測得峰面積，計算RSD，對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.62%和0.52%。RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

圖1 保健食品緩解視疲勞片的HPLC圖

2.8 穩(wěn)定性試驗

分別取同一對照品溶液和同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，6，9，12，15，22，23和24 h按照2.1小節(jié)的色譜條件各進樣1次，測得全反式葉黃素峰面積，計算RSD。對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.98%和0.51%，均小于2%，表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗

取同一批樣品（20180901批），按照2.3小節(jié)平行制得6份供試品溶液，按照2.1小節(jié)的色譜條件測定，計算全反式葉黃素的含量及RSD值。結果表明，全反式葉黃素含量為2.04 mg·g-1，RSD為1.26%，表明該方法重復性良好。

2.1 0 回收率試驗

取7.964 mg對照品（純度0.856%），精密稱定于25 mL棕色量瓶中，用0.1% BHT的乙醇溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.272 7 mg·mL-1的加標溶液。

取150 mg（樣品中葉黃素含量為0.002 04 mg·kg-1）本品（20180901批），精密稱定于100 mL棕色容量瓶中，分別加入0.5，1.0和1.5 mL對照品溶液，按照2.3小節(jié)分別制備低（0.5︰1）、中（1.0︰1）、高濃度（1.5︰1）的加樣供試品溶液，每種濃度分別制備3份平行樣，共9份。按照2.1小節(jié)的色譜條件進行測定。結果見表1。全反式葉黃素的平均回收率為100.48%，RSD為1.59%。平均回收率均為95%～105%，RSD小于2%，說明方法準確性較好。

表1 全反式葉黃素的加樣回收率試驗（N=9）

2.1 1 樣品含量測定

取3批緩解視疲勞片樣品（批號分別為20180901，20180902和20180903），按照2.3小節(jié)制備供試品溶液，按照2.1小節(jié)的色譜條件進行測定，結果見表2。計算全反式葉黃素的理論含量為1.9 mg·kg-1，由表2可知實測值與理論值較為接近。

表2 3批樣品含量測定結果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

通過查閱文獻，C30為固定相色譜柱分離類胡蘿卜素的幾何異構體具有明顯的優(yōu)勢[16]。因此選擇Reprospher C30-DE（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch ultimate? XB-C30（4.6 mm×250 mm，5 μ m）、YMC Carotenoid C30（4.6 mm×250 mm，5 μ m）3種不同品牌的C30色譜柱作為考察對象。結果表明，使用Reprospher C30色譜柱，全反式葉黃素和玉米黃質合并為1個峰，無法將2種物質分離；使用Welch ultimate?XB-C30色譜柱，全反式葉黃素和玉米黃素未達到基線分離；使用YMC Carotenoid-C30色譜柱，全反式葉黃素和玉米黃素達到基線分離，峰型好，所以選擇YMC Carotenoid-C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

3.2 流動相的選擇

對乙腈-甲基叔丁基醚、乙腈-甲醇-甲基叔丁基醚、甲醇-水-甲基叔丁基醚分別進行考察，確定甲醇-水-甲基叔丁基醚為流動相，為使全反式葉黃素與雜質峰能達到基線分離，降低B相甲基叔丁基醚的比例，發(fā)現(xiàn)隨著甲基叔丁基醚比例降低，全反式葉黃素出峰時間延長，全反式葉黃素與雜質分離效果越好，但是降低到一定程度，全反式葉黃素出峰時間太長，峰型較寬。通過對比例的摸索，確定流動相0～30 min，B 0%～50%；30.0～30.1 min，B 50%～0%；30.1～40.0 min，B 0%。在此條件下，全反式葉黃素、順式葉黃素及玉米黃素均可得到基線分離。

3.3 破囊溶劑的選擇

為增加葉黃素在制劑中的穩(wěn)定性，葉黃素往往以微囊包合物的形式加入到產(chǎn)品中[17]，對于供試品的制備方法，需先進行破囊處理，由于囊材是由玉米淀粉和辛烯基琥珀酸淀粉鈉包合成微囊，因此選擇對微囊具有一定溶解性的溶劑先進行破囊處理。分別考察水、N, N-二甲基甲酰胺、無水乙醇不同破膜溶劑，發(fā)現(xiàn)N, N-二甲基甲酰胺和水對全反式葉黃素含量無顯著性差別，但是水經(jīng)濟、環(huán)保，最終確定水作為破囊溶劑。

3.4 指標選擇

國家標準以全反式及順式葉黃素之和計算葉黃素的含量，原因是食品中未經(jīng)包合的葉黃素容易受外界環(huán)境的影響轉變成順式，但葉黃素經(jīng)微囊包合后穩(wěn)定性提高。研發(fā)的產(chǎn)品經(jīng)影響因素考察（高溫60 ℃、高濕90%、強光），5和10 d的葉黃素含量均無明顯變化，確實說明該產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好，且順式異構體中含量最高的占全反式比例的1.5%，順式異構體總和約占全反式比例的4.5%，含量較低。另外，有文獻報道，順式葉黃素生物活性低[3]，決定產(chǎn)品質量的成分為全反式葉黃素。因此選擇含量高、穩(wěn)定性好、生物活性高的全反式葉黃素進行定量。

3.5 對照品濃度的校準

國家標準中規(guī)定對照品的純度為98%，但經(jīng)文獻研究，葉黃素中總會混有3%～6%的玉米黃素，二者為同分異構體[18]，分離十分困難，試驗采用Sigma公司的對照品，經(jīng)GC-MS聯(lián)用測得全反式葉黃素純度為85.6%，這與采用HPLC-UV測得的結果一致，全反式葉黃素在24 h內(nèi)穩(wěn)定存在，因此無需對對照品濃度進行校正。

4 結論

采用YMC Carotenoid-C30色譜柱能夠將全反式葉黃素和玉米黃素分開，且能對全反式葉黃素準確定量。經(jīng)過系統(tǒng)方法學驗證，該方法專屬性、精密度、準確性、重復性等均符合要求。該方法供試品處理操作簡便，結果計算簡單，適用于緩解視疲勞類產(chǎn)品中全反式葉黃素的含量測定，為該類產(chǎn)品的質量控制提供參考依據(jù)。