張曉云，何秀玲，李培鋒，毛偉，孫華，白玉廷*

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院（呼和浩特 010018）；2. 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室（呼和浩特 010018）

紅霉素（Erythromycin，ERM）屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，分別是由紅霉素A、B、C和D 4種結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的組分所組成的混合物，其中紅霉素A是最重要的成分，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，抗菌活性最強（是其它組分的約3～5倍），因而將紅霉素A作為臨床上最常用藥物。紅霉素主要具有抗革蘭氏陽性細菌的作用，其機制是通過基因易位干擾微生物蛋白質(zhì)合成。據(jù)記載[1-3]，紅霉素在畜體內(nèi)的藥物表觀分布容積（Vd）比較大，馬靜注12.5 mg/kg時，Vd為5 539 mL/kg；黃牛、水牛、豬靜注8 mg/kg，其Vd分別為1 620.38，3 206.23和3 260.63 mL/kg；山羊靜注8 mg/kg，Vd值為4 286.97 mL/kg，表明紅霉素在體內(nèi)分布很廣，這與紅霉素的血漿蛋白結(jié)合率很低有關(guān)。文獻[3]記載紅霉素的血漿蛋白結(jié)合率為18%～40%。因紅霉素的堿性和高脂溶性的特性，導(dǎo)致其在組織中的濃度高于血清中濃度，這種影響在奶中更為明顯，奶中紅霉素水平在同一時間內(nèi)相當于血清中水平的2倍。

測定動物源性食品中紅霉素殘留的方法主要有微生物抑制法[4]、薄層色譜（TLC）法[5]、液相色譜-二極管陣列檢測（LC-DAD）法[6]、液相色譜-電噴霧（LC-CAD）法[7]和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[8]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、精確度好，是檢測紅霉素殘留的主要方法。農(nóng)業(yè)部235號公告中規(guī)定牛/羊奶中紅霉素的最高殘留限量（MRL）為40 μg/kg，文獻報道中關(guān)于牛奶中紅霉素殘留的測定，劉艷琴等[9]測定牛奶中紅霉素殘留量，前處理用乙腈提取樣品，經(jīng)ZORBAX Eclipse SB-C18（1.8 μm，3.0 mm×50 mm）分離，流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈（30︰70，V/V），采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測，結(jié)果顯示，檢測限為2.0 μg/L，定量限為5.0 μg/L，樣品回收率為88.2%～92.0%，RSD為1.67%。郭春海等[10]測定牛奶中6種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留量，乙腈提取樣品，采用OasisHLB固相萃取柱凈化提取液，過Agilent EclipseXDB-Pheny1苯基柱（5 μm，2.1 mm×150 mm），流動相為甲醇和0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫，采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測，結(jié)果顯示，檢測限為1 μg/kg，方法回收率為81.5%～96.1%，RSD為3.29%～9.96%。García-mayor等[11]開發(fā)一種基質(zhì)固相分散（MSPD）的提取方法，用于羊奶中紅霉素及其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留分析。Juan等[12]開發(fā)一種加壓液相萃取-LCMS/MS法測定牛奶和肉類中大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類抗生素的殘留方法。國內(nèi)外對于牛奶的紅霉素檢測方法報道較多，但關(guān)于羊奶中紅霉素殘留的檢測國內(nèi)尚未有報道。

羊奶的營養(yǎng)價值高，是國內(nèi)外一致強烈認同的最接近人奶的一種乳品，被國際營養(yǎng)學(xué)界譽為“奶中之王”，大量文獻報道羊奶與牛奶相比的優(yōu)點有：更容易被人體消化吸收、長期飲用不會導(dǎo)致發(fā)胖、美容養(yǎng)顏、抗過敏、增強抵抗力、預(yù)防心腦血管疾病、降低膽固醇[13-17]。隨著羊奶產(chǎn)業(yè)化進程的發(fā)展和廣大消費者對羊奶營養(yǎng)價值的認同，羊奶消費市場已初步形成。因此建立一種以解決中國當前乳和乳制品行業(yè)的殘留問題成為當務(wù)之急[18-20]。試驗建立的LC-MS/MS方法采用QuEChERS樣品前處理包，80%乙腈水溶液提取，醋酸鈉和MgSO4萃取，石墨炭黑和檸檬酸鈉吸附凈化。步驟簡便、易操作且回收率較高，不需要耗費固相萃取柱，且不需要氮氣濃縮，適合羊奶樣品的定性與定量檢測。該方法的建立能很好地分析羊奶中痕量水平的紅霉素殘留，大幅提高檢測效率，為羊奶中紅霉素殘留的常規(guī)檢測提供可靠方法。

圖1 紅霉素的分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 6460高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；色譜柱，CAPCELL PAK MGⅡ-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；離心機（≥15 000 r/min，Thermo）；分析天平（感量分別為0.000 1 g和梅特勒0.000 01 g，奧豪斯儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；乙腈（Sigma公司）；氨水（分析純）；QuEChERS樣品前處理包（型號PQS-1）；試驗用水符合GB/T 6682規(guī)定一級水要求；標準品：紅霉素（純度大于99%，CAS 59319-72-1，Sigma公司）；羅紅霉素（純度≥90%，CAS 80214-83-1，Sigma公司）；羊奶（無紅霉素殘留）。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 樣品處理

制樣：稱取5 g（精確到0.000 1 g）羊奶樣品于50 mL萃取管（氯化鈉+醋酸鈉）中，分別添加乙腈配制的紅霉素標準品溶液使其為0，20，40，80，200，400和800 ng/g（經(jīng)處理，上樣濃度分別為0，5，10，20，50，100和200 μg/kg）和乙腈配制濃度50 μg/kg（200 ng/g）的羅紅霉素溶液。

萃?。合蜉腿」苤屑尤?0 mL 80%乙腈水溶液，渦旋振蕩2 min，將鹽包（無水MgSO4+醋酸鈉）打開，將鹽全部加入萃取管中，渦旋振蕩2 min，以5 000 r/min離心5 min。

凈化：準確移取5 mL上清液于凈化管（石墨炭黑和檸檬酸鈉）中，渦旋混勻1 min，以5 000 r/min離心3 min，吸取1 mL過濾膜，待LC-MS/MS測定。

1.2.2 標準品溶液和內(nèi)標溶液的配制

稱取約1.00 mg（0.001 00 g）紅霉素標準品于1.5 mL EP管中，精密稱定。加入相當量乙腈溶解，配制成1.00 mg/mL標準儲備液。稱取約1.00 mg（0.001 00 g）羅紅霉素標準品于1.5 mL EP管中，精密稱定。加入相當量乙腈溶解，配制成1.00 mg/mL標準儲備液，于4 ℃保存。

1.2.3 LC-MS/MS色譜與質(zhì)譜條件及其優(yōu)化

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱，CAPCELL PAK MGⅡ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相，乙腈-0.5%氨水（92︰8），流速0.8 mL/min，等度洗脫，運行時間8.5 min；柱溫30 ℃；進樣量5 μ L；參考出峰時間紅霉素3.608 min，內(nèi)標物質(zhì)出峰時間4.946 min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓4 000 V；離子傳輸毛細管溫度350 ℃；源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓7 V；霧化器流速8 L/min。

紅霉素屬于弱堿性化合物（含N原子），分子量大，適合用較大質(zhì)量適用范圍的ESI離子源，故選擇MRM正離子模式采集數(shù)據(jù)。將0.5 mg/L紅霉素標準溶液進行全掃描，在正離子掃描下，特征離子峰（m/z=734.4）豐度最高作為紅霉素的母離子，進行二級質(zhì)譜裂解后，優(yōu)化碰撞氣能量及去簇電壓，將其734.4/576.3和734.4/158.1分別作為紅霉素定性離子對，將734.4/158.1作為紅霉素定量離子對，如圖2所示。

圖2 紅霉素的子離子掃描圖

1.2.4 線性范圍與線性方程

在該方法所確立的試驗條件下，精確稱定約5 g羊奶樣品，按照1.2.1小節(jié)的方法配制的紅霉素溶液，和羅紅霉素溶液添加到空白羊奶樣品中進行液質(zhì)聯(lián)用測定，以紅霉素/羅紅霉素的響應(yīng)峰面積（Y軸）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X軸，μ g/kg）作圖。

1.2.5 方法靈敏度

方法的靈敏度指該方法對單位濃度或單位量的待測物質(zhì)的變化所引起的響應(yīng)量變化的程度，可用儀器的響應(yīng)值與對應(yīng)的待測物質(zhì)的濃度或量之比描述。

1.2.6 方法的準確度與精密度考察

采用標準添加法，在空白羊奶中添加3個不同濃度（10，50和200 μg/kg）紅霉素，50 μg/kg羅紅霉素進行回收率試驗，每個濃度進行5次重復(fù)測定。記錄紅霉素峰面積（C1）與內(nèi)標羅紅霉素峰面積（C2），把C1/C2的比值代入標準曲線，計算出藥物濃度S1，并與實際加入標準濃度值S2進行比較，計算相對回收率。各濃度在1 d內(nèi)測6次；每一濃度隔天測定1次，連續(xù)測定6次，計算日內(nèi)、日間RSD。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

取質(zhì)量濃度分別為10，50和200 μ g/kg的羊奶樣品進行色譜分析，每個濃度平行測3次，分別考察其在4℃，室溫和-20 ℃下保存1周的穩(wěn)定性。

1.2.8 空白試驗

除不加標準品外，采用完全相同的步驟進行平行操作。

1.2.9 重復(fù)性試驗

按1.2.1小節(jié)的方法制成紅霉素上樣濃度分別為5，10，20，50，100和200 μ g/kg，羅紅霉素標準工作液濃度為50 μg/kg加入到空白羊奶中進行上述色譜及質(zhì)譜分析，以內(nèi)標法計算含量，每個濃度重復(fù)6個樣。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 17.0軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗數(shù)據(jù)用表示。

2 方法學(xué)考察

2.1 線性范圍與線性方程

以0，5，10，20，50，100和200 μg/kg空白羊奶中紅霉素濃度為橫坐標，以LC-MS/MS檢測出的紅霉素峰面積與內(nèi)標羅紅霉素的峰面積比值為縱坐標，做線性回歸。定量離子對的響應(yīng)峰面積和樣品濃度之間有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=0.021 5x-0.034 7，r2=0.999 8，檢測范圍為0～200 μ g/kg。詳見圖3。

2.2 方法靈敏度

選取一系列較低質(zhì)量濃度的紅霉素標準工作溶液，按該方法進行分析檢測，計算LOD和LOQ。采用乙腈配制標準曲線，將紅霉素藥物的LOD定為5 μg/kg（S/N＞3），LOQ定為20 μg/kg（S/N＞20，RSD＜10%）。

2.3 方法的準確度

回收率測定結(jié)果見表1。回收率符合LC-MS/MS檢測要求，可用于測定羊奶中紅霉素濃度。

圖3 羊奶樣品標準曲線

表1 不同添加濃度下羊奶樣品中紅霉素的回收率（n=5）

2.4 精密度考察

測定所建立檢測方法的日內(nèi)精密度與日間精密度，結(jié)果見表2。高、中、低3個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度相對標準偏差均小于3%，日間精密度相對標準偏差均小于10%，均符合LC-MS/MS檢測要求。

表2 檢測羊奶樣品中紅霉素方法的精密度（，n=6）

表2 檢測羊奶樣品中紅霉素方法的精密度（，n=6）

濃度/(μ g·kg-1)(μ g·kg-1) RSD/% 測定值/(μ g·kg-1) RSD/%日內(nèi)精密度 日間精密度測定值/10 9.13±0.17 1.9 10.66±1.05 9.8 50 50.68±1.21 2.4 48.71±4.28 8.8 200 200.95±5.68 2.8 199.62±16.97 8.5

2.5 穩(wěn)定性試驗

結(jié)果表明，在4 ℃，室溫和-20 ℃下保存1周，結(jié)果均穩(wěn)定（RSD＜7%）。

表3 不同溫度條件下紅霉素在羊奶中的穩(wěn)定性研究結(jié)果（，n=3）

表3 不同溫度條件下紅霉素在羊奶中的穩(wěn)定性研究結(jié)果（，n=3）

% -20 ℃ RSD/%10 13.51±0.90 6.7 10.88±0.47 4.3 11.51±0.17 1.5 50 45.69±2.92 6.4 48.93±1.09 2.2 48.26±0.46 1.0 200 201.36±2.72 1.4 200.39±3.97 2.0 200.91±5.13 2.6(μ g·kg-1) 4 ℃ RSD/濃度/% 室溫 RSD/

2.6 空白試驗與專屬性考察

在建立的LC-MS/MS檢測條件下的0～6.4 min內(nèi)無干擾峰出現(xiàn)，基線平穩(wěn)（圖4B）。羊奶空白樣品中加入紅霉素和羅紅霉素，在該色譜條件下保留時間分別為3.608和4.946 min，色譜峰之間無干擾，分離度為1.87分，離效果良好；紅霉素的拖尾因子為0.8，羅紅霉素的拖尾因子為1.3，在確定的色譜條件下雖有拖尾（前延），但均在規(guī)定范圍內(nèi)（不超過1.5），不影響峰面積的準確測量（圖4A）。

圖4 色譜圖

2.7 重復(fù)性試驗結(jié)果

試驗顯示，羊奶空白樣品中紅霉素的平均含量分別為5.5，9.69，19.18，48.81，99.55和200.53 μ g/kg，RSD分別為4.41%，1.26%，0.57%，1.29%，1.48%和3.99%，表明該方法重復(fù)性好。

3 討論

3.1 流動相的選擇

流動相中只有加入NH4OH紅霉素和羅紅霉素才能完整出峰，質(zhì)譜測定只能用3種鹽：甲酸銨、乙酸銨、氨水，其中乙酸銨和甲酸銨對于峰形改變不大；對于氨水濃度的選擇，試驗比較1.5%，0.5%和0.2% 3種不同濃度氨水，試驗證實選擇1.5%氨水溶液時，氨水濃度太大，易與空氣中的CO2結(jié)合，形成(NH4)2·CO3沉淀，大批量樣品測定時，會與流動相中乙腈相結(jié)合造成色譜柱堵塞；選擇0.2%氨水溶液時，色譜圖中紅霉素與羅紅霉素可分離，峰低矮圓潤，峰形對稱不完全，拖尾較嚴重，保留時間延后；在0.5%氨水溶液情況下，紅霉素與羅紅霉素分離完全，峰形對稱且尖銳，拖尾因子在規(guī)定范圍內(nèi)。故最終確定采用0.5%氨水溶液-乙腈作為流動相等度洗脫。

3.2 前處理方法的選擇

紅霉素殘留檢測的前處理方法主要有傳統(tǒng)液液萃取、固相萃取和分子印跡固相萃取等，但這些方法存在試劑量消耗大、操作步驟繁瑣、需使用特殊設(shè)備或需要特定的試驗環(huán)境等問題。對比其他處理方法，QuEChERS方法的優(yōu)勢有：回收率高；準確度和精密度高，可用內(nèi)標法進行校正；分析速度快，能在20 min內(nèi)完成6個樣品的處理；溶劑使用量少，污染小，價格較低且不使用含氯化物溶劑；操作簡便，無需良好訓(xùn)練和較高技能就可很好完成，可控性強；樣品制備過程中不使用玻璃器皿，裝置簡單。QuEChERS方法是一種快速、簡單、便宜、高效、耐用和安全的新興提取凈化技術(shù)，利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化目的，為解決上述問題提供了新方法。

4 結(jié)論

采用QuEChERS提取凈化方法，并結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量分析高靈敏度的優(yōu)勢，建立QuEC-hERS-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定羊奶中的紅霉素殘留的方法。采用電噴霧離子源ESI，正離子掃描，選擇MRM多反應(yīng)監(jiān)測，流動相為乙腈-氨水等度洗脫等色譜和質(zhì)譜條件，經(jīng)0.22 μm有機針孔濾膜過濾，采用羅紅霉素做內(nèi)標。在5～200 μ g/kg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，日內(nèi)精密度＜2%，日間精密度＜10%，方法的檢測限（LOD）為5 μg/kg，根據(jù)農(nóng)業(yè)部235號公告中規(guī)定紅霉素在羊奶中的MRL為40 μg/kg，以此MRL的1/2（20 μg/kg）作為紅霉素的定量限（LOQ）。在10，50和200 μg/kg的添加水平下，羊奶回收率為96.9%～100.3%，日內(nèi)精密度為1.9%～2.8%，日間精密度為8.5%～9.8%，特異性均符合LC-MS/MS檢測要求，因此試驗建立的方法準確、可靠，為乳制品中羊奶紅霉素殘留的定性和定量檢測提供依據(jù)。