吳雷，黃娟

江蘇旅游職業(yè)學院烹飪工藝與營養(yǎng)學院（揚州 225127）

生物酶法是一種有效提高植物蛋白性能的手段。李占方等[1]通過生物酶法進一步提高蛋白產(chǎn)品特性，并研究了酶處理對于樣品內(nèi)部化學鍵和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。孟丹陽等[2]通過小麥面筋蛋白酶解過程中對其功能性質(zhì)變化規(guī)律的研究，發(fā)現(xiàn)在相同的酶底物情況下，通過與中性蛋白酶、風味蛋白酶相比，堿性蛋白酶對小麥蛋白的酶解率最高。通過典型水解試驗來確定常見六種蛋白酶中適宜作為谷朊粉水解的蛋白酶，再通過單因素試驗和正交試驗對其工藝進行了優(yōu)化，得出最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

谷朊粉，購于山東渠風食品科技有限公司；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、氯化鈉、濃硫酸，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要設(shè)備與儀器

SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMMY公司；XW-80漩渦混合器，上海醫(yī)大儀器廠；TG 16-WS臺式高速離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；UV-7504 C型紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解液的制備

水解條件參考劉大川等[3]、張祥奎等[4]的方法并稍做修改。水解步驟如下：在燒杯內(nèi)加入4 g谷朊粉蛋白質(zhì)粉，加入200 mL緩沖溶液PBS，充分攪拌使其完全溶解，然后放入沸水內(nèi)使其蛋白質(zhì)變性利于后期酶解，酶解時間約10 min，然后取出將其溫度降至所需溫度。將酶解樣液pH調(diào)至7.0，溫度控制在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的木瓜蛋白酶；樣液pH調(diào)至2，溫度控制在37 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的胃蛋白酶；將樣液pH調(diào)至6，溫度控制在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；將酶解樣液pH調(diào)至8，溫度保持在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的堿性蛋白酶；將酶解樣液pH調(diào)至7.5，溫度控制在40 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的中性蛋白酶；將酶解樣液pH調(diào)至6.5，溫度保持在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的風味蛋白酶。待酶反應(yīng)完畢后，95 ℃保溫10 min以終止酶反應(yīng)。在酶反應(yīng)器中進行酶解的整個過程，且通過酸堿滴定控制pH。將所有最終水解液的pH調(diào)節(jié)至7.0，并在4 ℃，8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，收集上清液。

1.3.2 谷朊粉蛋白酶的篩選方法

分別用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（G）[5]、胃蛋白酶（P）[6]、風味蛋白酶（F）[7]、木瓜蛋白酶（Pa）[8]、堿性蛋白酶（N）[9]、中性蛋白酶（D）[10]，在其推薦最適條件下對谷朊粉進行酶解，并測定酶解物的水溶性蛋白質(zhì)含量和DH。

1.3.3 酶解改性谷朊粉工藝優(yōu)化方法

1.3.3.1 酶解初始工藝

在容量為1 000 mL的三角瓶中加入100 g谷朊粉，瓶口用紗布封住，在121 ℃環(huán)境下滅菌20 min，將溫度降至常溫后備用。在谷朊粉溶液濃度8%、酶解時間4 h、pH 8.5、加酶量0.8%及酶解溫度55 ℃（恒溫水浴鍋）的條件下進行水解，并用0.1 mol/L的NaOH使pH維持在8.5左右。酶解反應(yīng)結(jié)束后，將試管迅速轉(zhuǎn)移至沸水中加熱鈍化蛋白酶，加熱時間5 min。通過噴霧干燥機對改性谷朊粉進行干燥，用100目網(wǎng)篩將谷朊粉過篩后待用。

1.3.3.2 酶解改性谷朊粉工藝優(yōu)化方法

1.3.3.2.1 單因素優(yōu)化方法

以酶解改性后谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH為指標，對影響谷朊粉酶解的因素進行單因素分析，對酶解溫度、酶解時間、pH、底物濃度、加酶量五個因素進行考察試驗，具體處理方法如下：

酶解溫度優(yōu)化：將酶解液、谷朊粉及水混合物置于恒溫水浴鍋中水浴，溫度分別控制在33，37，40，55和60 ℃，其余條件同初始工藝。以谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH為評價指標，確定最適酶解溫度。

底物濃度優(yōu)化：將谷朊粉分別與酶解液和水混合后置于恒溫水浴鍋中水浴，其濃度分別為5%，10%，15%，20%及25%，其余條件同初始工藝。以谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH為評價指標，確定最適底物濃度。

加酶量優(yōu)化：將濃度為2%，3%，4%，5%及6%的酶解液分別與谷朊粉和水混合后置于恒溫水浴鍋中水浴，其余條件同初始工藝。以谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH為評價指標，確定最適加酶量。

酶解時間優(yōu)化：將酶解液、谷朊粉及水混合物分別于恒溫水浴鍋中水浴0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4和4.5 h，其余條件同初始工藝。以谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH為評價指標，確定最適酶解時間。

酶解pH優(yōu)化：將酶解液、谷朊粉及水混合物分別在不同pH（6，6.5，7，7.5，8.0，8.5及9.0）條件下于恒溫水浴鍋中水浴，其余條件同初始工藝。以谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH為評價指標，確定最適酶解pH。

1.3.3.2.2 正交試驗方法

因素水平設(shè)計：依據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，從而選擇對試驗結(jié)果影響較大的因素和較適宜的試驗水平，采用L16(45)正交表（表1）進行正交試驗。

最佳工藝條件驗證：通過單因素試驗和正交試驗得出的最適條件進行酶解驗證。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4 酶解谷朊粉水溶性蛋白的測定方法

根據(jù) GB 5009.5—2016[11]，使用 Foss 5800 Kjeltec凱式定氮儀測定樣品蛋白質(zhì)含量和水溶性蛋白含量，蛋白系數(shù)為5.7[12]。

1.3.5 酶解谷朊粉DH的測定方法

試驗采用TNBS法[13]測定水解度。參考Adler-Nissen等[14]、周慧江等[15]的方法并略作修改。

L-亮氨酸溶液的配制： 精確稱取0.12 mg L-亮氨酸，用1% SDS水溶液溶解并定容到500 mL容量瓶中，此標準溶液的L-亮氨酸含量約為0.24 g/L。取0，2.5，5.0，7.5和10.0 mL的L-亮氨酸標準溶液，分別與10，7.5，5.0，2.5和0 mL的1% SDS混合，使配置好的L-亮氨酸溶液濃度分別為0，0.6，0.12，0.18和0.24 mg/L。

L-亮氨酸溶液標準曲線繪制：取2 mL的磷酸鹽緩沖液于試管，并向其加入250 μL的L-亮氨酸溶液和2.0 mL TNBS溶液。搖勻后在50 ℃水浴保溫，避光振蕩60 min[16]。振蕩結(jié)束后，加入4 mL的0.1 mol/L HCl中止反應(yīng)，室溫下冷卻30 min，在340 nm處測定吸光度。

以發(fā)酵時間為橫坐標，以不同濃度對應(yīng)的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品中DH的測定：取250 μL水解樣加入到試管中，加入2.0 mL磷酸鹽緩沖液，再加入2.0 mL TNBS溶液，搖勻。在50 ℃水浴保溫，避光振蕩60 min。振蕩結(jié)束后，加入4 mL的0.1 mol/L HCl中止反應(yīng)，在室溫下冷卻30 min，在340 nm處測定吸光度。

按式（2）計算水解度：

式中：AN1為蛋白水解前氨基氮含量，mmol/g蛋白；AN2為蛋白水解后氨基氮含量，mmol/g蛋白；NPb為蛋白底物中肽鍵氮含量，mmol/g蛋白，即蛋白氮。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷朊粉蛋白酶的篩選結(jié)果

將谷朊粉的濃度控制在10%作為酶解底物，采用6種酶（谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶）分別在其最適條件下對谷朊粉進行典型水解試驗。以水溶性蛋白含量及DH為檢測指標來篩選最佳的酶對谷朊粉進行酶解改性。

從圖1可以看出，六種酶在其最適條件下，它們的水溶性蛋白質(zhì)含量和DH有著明顯的區(qū)別。其中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（G）、胃蛋白酶（P）、風味蛋白酶（F）、木瓜蛋白酶（Pa）四種酶酶解谷朊粉之后底物中水溶性蛋白質(zhì)的含量和DH含量并不突出，而堿性蛋白酶（N）和中性蛋白酶（D）兩種酶水解效果較好，水溶性蛋白質(zhì)含量分別為43.98%和18.36%，DH分別為40.17%和15.64%，但N的水解效果略高于D，因此，后續(xù)試驗選擇N作為酶解改性谷朊粉的蛋白酶。

注：酶：G（谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶）；P（胃蛋白酶）；F（風味蛋白酶）；Pa（木瓜蛋白酶）；N（堿性蛋白酶）；D（中性蛋白酶）；A，水溶性蛋白含量；B，DH；圖中標注不同小寫字母代表組內(nèi)差異顯著（p＜0.05），相同小寫字母代表組內(nèi)無顯著性差異（p＞0.05）

2.2 酶解工藝的單因素優(yōu)化結(jié)果

通過典型水解試驗，以水溶性蛋白質(zhì)和DH為指標，在六種蛋白酶推薦最適水解條件下酶解谷朊粉，經(jīng)過分析選擇了堿性蛋白酶作為水解谷朊粉的蛋白酶。

2.2.1 酶解溫度優(yōu)化結(jié)果

酶解溫度對蛋白酶酶解谷朊粉具有很大的影響，因為蛋白酶都有其最適的溫度。在堿性蛋白酶的最適溫度下，隨著溫度的升高反應(yīng)物的能量和分子間有效接觸的頻率增加，因而反應(yīng)速度加快，其酶活性可以達到提高，水解效果得到提升；但如果溫度過高，蛋白酶易變性失活，導致水解度下降。由圖2可以看出，堿性蛋白酶酶解谷朊粉在不同溫度的條件下具有明顯的區(qū)別：30～40 ℃之間，水溶性蛋白質(zhì)含量和DH的含量不高，即堿性蛋白酶在此段溫度下活性不高；在55～60 ℃下，結(jié)果顯示堿性蛋白酶活性較高，即堿性蛋白酶在此溫度段較適應(yīng)，水溶性蛋白質(zhì)和DH含量在55 ℃時分別達到47.28%和25.84%，表明酶解谷朊粉具有較好的水溶性，故55 ℃為酶解谷朊粉最佳溫度。

圖2 酶解溫度對酶解的影響

2.2.2 底物濃度優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知，不同的底物濃度對發(fā)酵谷朊粉具有較大的影響。

結(jié)果顯示：當?shù)孜餄舛葹?0%時，堿性蛋白酶水解谷朊粉酶解底物中水溶性蛋白質(zhì)和DH含量最高，分別為38.18%和22.18%，說明堿性蛋白酶水解谷朊粉在底物濃度為10%時具有較好的均勻分散性，水溶性較好；當?shù)孜餄舛葹?5%～25%時，水溶性蛋白質(zhì)和DH含量都不盡理想；當?shù)孜餄舛容^低時，堿性蛋白酶所接觸的谷朊粉不夠充分，水溶性蛋白質(zhì)和DH含量不高。故酶解谷朊粉最佳底物濃度為10%。

2.2.3 加酶量優(yōu)化結(jié)果

酶的加入量在谷朊粉酶解中具有重要作用，通過圖4可以看出，2%的加酶量不能使谷朊粉較好酶解，水溶蛋白質(zhì)和DH只有18.38%和7.82%，相較于4%的加酶量所得出的水溶性蛋白質(zhì)含量和DH（分別為40.12%和22.13%）具有較大差距；當酶的添加涼量達到4%時，水溶性蛋白質(zhì)含量和DH基本保持穩(wěn)定。故酶解谷朊粉最佳加酶量為4%。

圖3 底物濃度對酶解谷朊粉的影響

圖4 加酶量對酶解谷朊粉的影響

2.2.4 酶解時間優(yōu)化結(jié)果

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，水溶性蛋白質(zhì)含量和DH都呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢。酶解時間在3.5 h之前水溶性蛋白質(zhì)含量和DH都呈現(xiàn)迅速上升的趨勢，說明酶解時間在3.5 h之前堿性蛋白酶在谷朊粉中活性較強；3.5 h之后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢，在酶解后期所需要的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)消耗殆盡，所以之后水溶性蛋白質(zhì)含量和DH基本保持穩(wěn)定。故酶解谷朊粉最佳酶解時間為3.5 h。

圖5 酶解時間對酶解谷朊粉的影響

2.2.5 酶解pH優(yōu)化結(jié)果

由圖6可知，中性和弱酸性的環(huán)境都不利于堿性蛋白酶的水解谷朊粉，弱堿性環(huán)境則更有利于堿性蛋白酶水解谷朊粉。通過試驗結(jié)果可知，當酶解pH為8.0時酶解谷朊粉后水溶性蛋白含量和DH分別為40.41%和23.42%，酶解谷朊粉效果較好。故酶解谷朊粉最佳酶解pH為8.0。

2.3 酶解改性工藝的正交優(yōu)化結(jié)果及驗證

2.3.1 正交優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）、底物濃度（C）、加酶量（D）和pH（E）為因素，選取酶解后DH作為評價指標，采用L16(45)正交設(shè)計對工藝條件進行優(yōu)化。

由表2可以得出，酶解后底物中DH高達34.18%，組合為酶解時間4 h、加酶量5%、酶解溫度55 ℃、底物濃度10%、發(fā)酵pH 7.0。通過單因素試驗可知，含水量太低使底物濃度增大，蛋白酶在底物中不易均勻分散，降低酶解效果。由極值分析得出影響酶解谷朊粉產(chǎn)物DH的因素主次順序為酶解溫度＞底物濃度＞酶解時間＞加酶量＞pH，按各因素水平應(yīng)選擇A4B3C2D3E4作為最佳酶解組合，即酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、加酶量3%、底物濃度10%、酶解pH 8.5。

圖6 酶解pH對酶解谷朊粉的影響

表2 正交試驗結(jié)果

2.3.2 驗證試驗

在酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、加酶量3%、底物濃度10%、酶解pH 8.5的酶解條件下，測得酶解液中水溶性蛋白質(zhì)含量為43.98%、DH為18.36%，比優(yōu)化前水溶性蛋白提高了48.13%，DH提高了14.41%。

3 討論

以谷朊粉為底物，通過典型水解試驗考察了六種常用蛋白酶水解效果，試驗結(jié)果顯示：N（堿性蛋白酶）和D（中性蛋白酶）兩種酶水解谷朊粉效果較其他四種酶好，能夠顯著提高谷朊粉的水溶性，但N的水解效果略高于D，因此，后續(xù)試驗選擇N作為酶解改性谷朊粉的蛋白酶。蛋白酶都有適宜的酶解溫度，試驗結(jié)果顯示在55～60 ℃下，水溶性蛋白質(zhì)含量和DH在55 ℃時分別達到47.28%和25.84%，表明酶解谷朊粉在55 ℃時具有較好的水溶性。通過底物濃度與酶解效果的影響試驗，發(fā)現(xiàn)中低濃度的底物濃度更有利于水溶性蛋白質(zhì)含量和DH的生成，即有利于谷朊粉水溶性的提高，當?shù)孜餄舛葹?0%時，堿性蛋白酶水解谷朊粉酶解底物中水溶性蛋白質(zhì)和DH含量最高，分別為38.18%和22.18%。

谷朊粉酶解和酶的添加量也有較大的關(guān)系，試驗證明顯示加酶量為4%時水溶性蛋白質(zhì)含量和DH分別為40.12%和22.13%，谷朊粉水溶性提高較多。當加入的酶較少時，則底物中谷朊粉含量較多，即較少的酶無法充分利用底物中的谷朊粉，谷朊粉利用率低，導致水溶性蛋白質(zhì)含量和DH較低；過高的酶可以利用底物中全部的谷朊粉，但會導致成本上升，不利于實際生產(chǎn)。酶解時間在3.5 h時，水溶性蛋白質(zhì)含量為48.13%，DH為27.14%，使谷朊粉具有較好的水溶性。試驗結(jié)果顯示，當pH 8.5時，水溶蛋白質(zhì)含量和DH達到最高。酶解pH過低或過高都不利于酶活性的表達，造成酶解反應(yīng)水解度的降低。

4 結(jié)論

通過典型水解試驗從常見六種蛋白酶中篩選出水解谷朊粉的最佳蛋白酶，為堿性蛋白酶。水解試驗顯示堿性蛋白酶水解谷朊粉水溶性蛋白質(zhì)含量和DH分別為43.98%和18.36%，使酶解后谷朊粉具有較好的溶解性。

單因素試驗結(jié)果顯示：最佳酶解溫度為55 ℃，最佳底物濃度為10%，最佳加酶量為3%～4%，最佳酶解時間為3～4 h，最佳酶解pH為7.5～8.5。通過正交試驗得出最優(yōu)因素主次順序為酶解溫度＞底物濃度＞酶解時間＞加酶量＞pH，且A4B3C2D3E4為最佳酶解組合，即酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、加酶量3%、底物濃度10%、酶解pH 8.5。