許俊齊，曹正*，王瑞，凡軍民，謝正林，劉勇

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院（句容 212400）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬真菌門(mén)，擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，靈芝屬，是一種珍貴的藥用真菌，含有多種生物活性物質(zhì)，如靈芝多糖、三萜類化合物和多種酶類，具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值[1]。中國(guó)古代稱其子實(shí)體為“仙草”[2-3]。

文獻(xiàn)報(bào)道表明，多糖類物質(zhì)（Polysaccharides）作為靈芝主要的有效化學(xué)物質(zhì)之一，靈芝多糖具有調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗HIV、降血壓等生物活性，且經(jīng)毒理學(xué)驗(yàn)證表明，靈芝多糖不會(huì)對(duì)人體健康造成負(fù)面影響[4-6]。靈芝多糖主要來(lái)源于固態(tài)發(fā)酵中的子實(shí)體和孢子以及液體發(fā)酵中的菌絲體和胞外發(fā)酵液，其產(chǎn)量的高低與試驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素密切相關(guān)[7-9]。

近年來(lái)由于野生靈芝資源有限且人工栽培靈芝子實(shí)體周期較長(zhǎng)、栽培成本高，限制了靈芝的廣泛應(yīng)用。目前，利用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)真菌具有容積大、產(chǎn)量高、周期短和無(wú)污染等特點(diǎn)，已成為醫(yī)藥和保健品、化妝品等原料的重要生產(chǎn)方式[9]。通過(guò)液體發(fā)酵所得靈芝菌絲體，產(chǎn)品苦味小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及有效成分不低于子實(shí)體，甚至有些指標(biāo)高于子實(shí)體，因而具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景[10-11]。

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)靈芝進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，分析相應(yīng)碳源、氮源及培養(yǎng)溫度與裝液量對(duì)其菌絲干質(zhì)量與總多糖含量的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行靈芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配配方進(jìn)行優(yōu)化，以期為靈芝菌絲產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝菌種及金針菇，江蘇食用菌研究所所提供；纖維素酶（120 U/g），任丘市力輝化工有限公司；食鹽、馬鈴薯等，市售；葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、蛋白胨和可溶性淀粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FA 2104 N分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-9123 A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；L 520微波爐，合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司；CH 2176電磁爐，杭州九陽(yáng)生活電器有限公司；HS-6恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，VB110 mg，水1 000 mL。

1.2.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

葡萄糖2%，酵母浸出膏15%，蛋白胨0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，VB10.005%，余量為水。

1.2.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

馬鈴薯20%，蔗糖2%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0. 05%，VB10.005%，余量為水。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

可溶性淀粉6%，葡萄糖2%，蛋白胨0.8%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，VB10.005%，余量為水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝菌絲飲品加工步驟

1.3.1.1 菌種活化

將靈芝菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d左右，菌絲可長(zhǎng)滿試管。

1.3.1.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)活化的靈芝菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中（500 mL的三角瓶裝液150 mL），一級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的靈芝菌種2 cm2，于28 ℃條件下，振蕩培養(yǎng)5～6 d。

1.3.1.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)

將一級(jí)搖瓶培養(yǎng)靈芝菌種的接種到搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)搖瓶培養(yǎng)，在28～30 ℃條件下，培養(yǎng)8 d，所得靈芝菌種為生產(chǎn)搖瓶二級(jí)種。

1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級(jí)種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，二級(jí)種與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)5 d，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一級(jí)靈芝菌種。

1.3.1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

一級(jí)靈芝菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)24～36 h后，過(guò)濾，得靈芝菌絲。

1.3.1.6 靈芝菌絲飲品制備

過(guò)濾后的靈芝菌絲球于35～40 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過(guò)200目篩。將靈芝菌絲球粉及適量水（1︰5）進(jìn)行均質(zhì)研磨，均質(zhì)完成后將靈芝菌絲球混液中加入0.2%纖維素酶，混勻后于38 ℃條件下保溫水解1.5 h，將混合料在100 ℃下殺菌10 min。

準(zhǔn)備好的靈芝菌絲酶解濾液，分別加入溶解完成的果膠及黃原膠，再依次加入金針菇粉、鮮柚濃縮汁、蜂蜜、檸檬酸、檸檬酸鈉，然后攪拌均勻，最后補(bǔ)水至配方規(guī)定的量；將定容后的料液加熱至沸，趁熱加灌入已滅菌的飲料瓶、壓蓋后105 ℃下殺菌10 min、冷卻后得靈芝菌絲發(fā)酵飲品。

1.3.2 液體培養(yǎng)基成分及條件單因素試驗(yàn)

前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，判定液體培養(yǎng)基中碳源可溶性淀粉含量、氮源中蛋白胨及培養(yǎng)溫度與不同裝液量的對(duì)靈芝液體菌絲生長(zhǎng)情況存在顯著影響，故設(shè)定可溶性淀粉添加比例為3%，4%，5%，6%和7%；蛋白胨添加量為0.6%，0.7%，0.8%，0.9%和1.0%；培養(yǎng)溫度與裝液量（以500 mL計(jì)）分別為20 ℃+120 mL，23 ℃+130 mL，26 ℃+150 mL，29 ℃+170 mL和32℃+180 mL，并以菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，確定三者最優(yōu)的添加量。

1.3.3 正交試驗(yàn)

從單因素中篩選出的不同水平的可溶性淀粉濃度、蛋白胨、培養(yǎng)溫度與不同裝液量，并設(shè)置一列空白列，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)定見(jiàn)表1。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，測(cè)定其菌絲體鮮質(zhì)量及總多糖含量。

表1 靈芝液體培養(yǎng)基正交L9(34)試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 正交試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，認(rèn)為鮮柚汁、金針菇粉及檸檬酸+檸檬酸鈉為影響靈芝菌絲體發(fā)酵飲品的關(guān)鍵因素。分別設(shè)定蔗糖添加比例為4%，5%和6%；設(shè)置食鹽添加量為0.01%，0.02%和0.03%，設(shè)置檸檬酸與檸檬酸鈉添加比例為0.3%+0.03%，0.4%+0.04%和0.4%+0.04%，設(shè)置果膠與黃原膠添加比例為0.04%+0.06%，0.05%+0.08%和0.06%+0.1%，并設(shè)置一列空白列，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)定見(jiàn)表2。

表2 靈芝菌絲發(fā)酵飲品L9(34)試驗(yàn)因素與水平

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.5.1 感官評(píng)定

取試樣置于燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。聞其氣味，用溫開(kāi)水漱口，品嘗滋味。感官品質(zhì)得分為3個(gè)指標(biāo)總和。感官評(píng)價(jià)由20名具有品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)同學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，取其平均值。

外觀（10～30分）：細(xì)膩潤(rùn)滑，組織連貫均一，無(wú)結(jié)塊和分層、無(wú)固體析出、色澤一致，無(wú)沉淀。

口感（10～40分）：口感爽滑，口味醇厚。

風(fēng)味（10～30分）：飲品的酸甜度適中、飲品香氣濃厚，獨(dú)特飲品酵香。

1.3.5.2 靈芝菌絲體干質(zhì)量測(cè)定方法

靈芝菌絲體發(fā)酵液，采用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，用稱質(zhì)量后的干燥濾紙抽濾，將菌絲體用蒸餾水抽濾3次，烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，即得靈芝菌絲體干質(zhì)量。

1.3.5.3 總多糖測(cè)定

總多糖測(cè)定：參照苯酚-硫酸法[12]。

1.3.5.4 微生物指標(biāo)的測(cè)定

菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

靈芝菌絲對(duì)淀粉的利用率較高，可溶性淀粉屬于緩慢型利用碳源，易于被靈芝菌絲體快速利用且可滿足菌絲后期生長(zhǎng)的需要，故靈芝液體菌種培養(yǎng)基中添加可溶性淀粉時(shí)，菌絲干質(zhì)量及總多糖含量隨添加比例的增高，而有所增加。可溶性淀粉添加量對(duì)靈芝菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響具體見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，麥芽糖添加量分別為5%和6%時(shí)，靈芝菌絲總多糖含量為1.441 g/L，靈芝菌絲干質(zhì)量達(dá)0.534 g/100 mL，可溶性淀粉添加量7%，菌絲干質(zhì)量及總多糖含量與添加比例6%時(shí)增加不明顯，故選擇可溶性淀粉添加量6%作為靈芝菌絲生長(zhǎng)最適添加比例。

圖1 可溶性淀粉添加量對(duì)靈芝菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，亦含有一些維生素和糖類，常被作為微生物培養(yǎng)基的主要原料。蛋白胨添加量對(duì)靈芝菌絲體干質(zhì)量及多糖含量的影響見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，蛋白胨添加量對(duì)靈芝菌絲干質(zhì)量及總多糖含量影響較為明顯，蛋白胨添加量0.8%時(shí)，每100 mL培養(yǎng)液中的菌絲鮮質(zhì)量達(dá)0.539 g，總多糖含量達(dá)1.365 g/L。隨添加比例增加，靈芝干質(zhì)量增加不明顯，總多糖含量反而趨于小幅下降。原因可能在于，過(guò)量營(yíng)養(yǎng)對(duì)于菌絲增長(zhǎng)并無(wú)明顯作用，據(jù)此選擇0.8%蛋白胨添加量為最適液體培養(yǎng)基添加量。

隨著培養(yǎng)溫度不斷升高及裝液量增加，靈芝菌絲干質(zhì)量不斷增加且總多糖含量也逐步增加，但在29 ℃后繼續(xù)升溫，菌絲量反而減少，可見(jiàn)29 ℃為最適培養(yǎng)溫度，具體見(jiàn)表3。培養(yǎng)溫度及裝液量為29 ℃、170 mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)0.534 g/100 mL，總多糖含量達(dá)1.414 g/L。培養(yǎng)基裝液量多，發(fā)酵液中溶氧量就少，影響菌球的生長(zhǎng)，而裝液量過(guò)少，雖然溶氧量很大，但營(yíng)養(yǎng)不足，菌絲干質(zhì)量及多糖含量就低。故選擇培養(yǎng)溫度29 ℃及裝液量170 mL為較佳的靈芝液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件。

表3 培養(yǎng)溫度及裝液量對(duì)靈芝菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

2.2 靈芝液體培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

液體培養(yǎng)基L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表4。

由表4液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)表中的R值可知，影響靈芝菌絲干質(zhì)量及總多糖含量的主次順序皆為：A＞B＞C，即培養(yǎng)溫度及裝液量＞可溶性淀粉添加量＞蛋白胨添加量。根據(jù)液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果分析得出，優(yōu)化后的配方為A2B3C3，即液體培養(yǎng)基最佳配比：培養(yǎng)溫度29 ℃、裝液量170 mL、可溶性淀粉添加量6.5%、蛋白胨添加量0.85%。靈芝菌絲在此配方及環(huán)境條件下生長(zhǎng)狀況良好，總多糖含量保持在較高水平。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，即在試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)溫度及裝液量與蛋白胨添加量對(duì)靈芝菌絲干質(zhì)量及菌絲總多糖含量影響極顯著（p＜0.01），可溶性淀粉添加量對(duì)兩者影響顯著（p＜0.05）。

表4 液體培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

獲得的優(yōu)化方案A2B3C3為試驗(yàn)中的9號(hào)試驗(yàn)組，為進(jìn)一步確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即培養(yǎng)溫度29 ℃、裝液量170 mL、蛋白胨添加量0.85%、可溶性淀粉添加量6.5%，進(jìn)行擴(kuò)大性（中試）驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定其菌絲干質(zhì)量平均值為0.597±0.012 g/100 mL，總多糖含量為1.522±0.014 g/L試驗(yàn)結(jié)果與9號(hào)試驗(yàn)組相近，表明該配方為較佳的靈芝液體培養(yǎng)條件及其組成。

2.3 靈芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

靈芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配L9(34)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，靈芝菌絲鮮質(zhì)量方差分析見(jiàn)表6。

從表5靈芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果中的R值可知，影響其綜合評(píng)分的因素主次順序?yàn)锽＞A＞C，即金針菇粉＞食鹽添加量＞檸檬酸與檸檬酸鈉。依據(jù)綜合評(píng)分的結(jié)果分析可知，優(yōu)化的工藝組合均為A2B3C3，即食鹽添加量0.03%、金針菇粉添加量0.6%、檸檬酸0.06%+檸檬酸鈉0.10%，制得的飲品外觀、口感及風(fēng)味的綜合值均保持在最高。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，表6數(shù)據(jù)顯示，在試驗(yàn)條件下，食鹽添加量與金針菇粉添加量對(duì)靈芝菌絲發(fā)酵飲品的綜合口感影響顯著（p＜0.05），而檸檬酸+檸檬酸鈉對(duì)其影響不顯著（p＞0.05）。

2.3.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

獲得的優(yōu)化方案A2B3C3為試驗(yàn)第9組試驗(yàn)，為進(jìn)一步確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，以其為條件，即靈芝菌絲飲品調(diào)配配方為：食鹽添加量0.03%、金針菇粉添加量0.6%、檸檬酸0.06%+檸檬酸鈉0.10%。進(jìn)行擴(kuò)大性（中試）驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，經(jīng)品評(píng)后，綜合得分達(dá)85.8分，試驗(yàn)結(jié)果均優(yōu)于正交試驗(yàn)的9組試驗(yàn)組，表明此配方為較佳的靈芝菌絲飲品的適宜配方。

2.4 微生物指標(biāo)檢驗(yàn)

靈芝菌絲飲品的微生物檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，靈芝菌絲飲品的細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，符合GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》中關(guān)于微生物限量要求。

表5 靈芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配L9(34)試驗(yàn)結(jié)果

表6 靈芝菌絲飲品方差分析

表7 微生物檢驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

對(duì)靈芝液體培養(yǎng)基碳源、氮源、培養(yǎng)溫度及裝液量進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，培養(yǎng)溫度29 ℃、裝液量170 mL、蛋白胨添加量0.85%、可溶性淀粉添加量6.5%，靈芝菌絲體菌絲干質(zhì)量平均值為0.597±0.012 g/100 mL，總多糖含量為1.522±0.014 g/L；在對(duì)靈芝菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝過(guò)程中，通過(guò)正交試驗(yàn)分析得出，最優(yōu)組合為：食鹽的添加量0.03%、金針菇粉添加量0.6%、檸檬酸0.06%+檸檬酸鈉0.10%。綜合感官評(píng)價(jià)認(rèn)為，此配方制得的靈芝菌絲飲品在保證口感的同時(shí)，后期貯藏驗(yàn)證其穩(wěn)定性也較高。

通過(guò)對(duì)在最佳工藝條件下制得的靈芝發(fā)酵菌絲飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其顏色均一，組織狀態(tài)均勻，無(wú)沉淀分層現(xiàn)象，在保留靈芝菌絲原有的活性功能基礎(chǔ)上，添加鮮柚濃縮汁及蜂蜜，使靈芝飲品的營(yíng)養(yǎng)更加豐富，風(fēng)味獨(dú)特，口感更加細(xì)膩，具有良好的市場(chǎng)前景。