汪洪濤，李清光，薛珂

江蘇經(jīng)貿職業(yè)技術學院健康學院，江蘇省食品安全工程技術研究開發(fā)中心（南京 211168）

羅漢果屬于我國的葫蘆科植物[1]，因其具有多種藥理作用而被稱為“中國神果”，其產地主要集中在廣西[2]。羅漢果花是羅漢果的干燥雄花，主要功效有清熱解毒、化痰止咳、養(yǎng)聲潤肺等，經(jīng)常應用于治療口臭、口腔炎等疾病[2]。羅漢果花中含有大量的黃酮類化合物，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗癌、增強免疫能力、提高和穩(wěn)定視力、保護神經(jīng)等生理活性[3]。隨著生活水平的提高及對自身健康的關注，人們的消費模式從傳統(tǒng)的果蔬加工食品如果醬和罐頭，開始向新鮮營養(yǎng)、方便無公害的鮮切果蔬轉變[4]。與新鮮果蔬相比，鮮切加工引起果蔬生理代謝紊亂，導致營養(yǎng)物質流失，產生褐變，使得保持鮮切產品的感官品質、營養(yǎng)品質及延長貨架期成為制約鮮切果蔬發(fā)展最大障礙[5]。因此天然保鮮劑因無毒副作用、安全、環(huán)保、衛(wèi)生、營養(yǎng)，很快就成為食品保鮮領域的“新寵”[6]，并成為近年來的研究熱點。

近年來對羅漢果的研究報道較多但對羅漢果花的開發(fā)研究較少，主要在黃酮[1]和皂苷[7]等方面，但對其提取液在果蔬保鮮方面的研究還未見報道，從而造成了羅漢果花資源的極大浪費。為了更好地開發(fā)利用羅漢果花資源，擬采用超聲波輔助提取羅漢果花中活性物質，通過單因素試驗和響應面試驗對提取工藝進行優(yōu)化，并利用提取液對鮮切蘋果進行保鮮效果研究，以進一步拓寬羅漢果花的應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

羅漢果花，市售，試驗前于65 ℃恒溫烘箱中烘干至恒質量后粉碎，裝于密封袋中備用；“紅富士”蘋果，市售。

無水乙醇、草酸、氫氧化鈉、氯化鋇、酚酞指示劑，均為分析純，百靈威化學試劑公司；總抗氧化能力測定試劑盒，南京森貝咖生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

YP 6001N電子天平，上海元析儀器有限公司；DL-120 B超聲波清洗器，合肥攀升超聲波科技有限公司；841型電熱恒溫干燥箱，上海耐美特烘干集團；UV-6100 S型紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；HWS-26數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海皓莊儀器有限公司；SHB-3 S型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；PAL-1型手持式折光儀，東京AWARO科技公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波輔助提取羅漢果花活性物質的基本工藝

在參考大量文獻資料的基礎上，最終確定乙醇為羅漢果花的最佳提取溶劑?；咎崛」に嚕簻蚀_稱取2 g羅漢果花樣品，在料液比為1︰15（g/mL）、乙醇體積分數(shù)為50%、溫度為50 ℃的條件下進行超聲波輔助提取，提取時間為1 h。提取后用真空泵進行抽濾，得到的提取液密封保存，待用。

1.2.2 提取液總抗氧化能力的測定

參照總抗氧化能力測定試劑 盒的說明書進行測定?？偪寡趸芰Φ亩x：在37 ℃的溫度下每分鐘每毫升羅漢果花提取液使反應體系的吸光度 每增加0.01時為一個總抗氧化能力單位[8]，按式（1）計算。

式中：反應液總量為4 mL；取樣量為0.1 mL；樣品質量為2 g。

1.2.3 單因素試驗

在基本提取工藝的基礎 上以羅漢果花提取液總抗氧化能力為評價指標，取羅漢果花樣品2 g，其他條件不變，分別改變提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、乙醇體積分數(shù)（0，20%，40%，60%，80%和95%）、提取時間（30，60，90，120，150和180 min）和料液比（1︰5，1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30 g/mL）進行試驗，從而確定每個因素的最佳水平。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗

基于單因素試驗，利用軟件Design Expert 8.0中的Box-Benhnken中心組合試驗設計原理[9]，以羅漢果花提取液總抗氧化能力作為響應值進行提取工藝優(yōu)化。

1.2.5 提取液對鮮切蘋果保鮮效果的研究

1.2.5.1 蘋果樣品處理

用無菌蒸餾水稀釋羅漢果花提取液至1 mg/mL的供試原液，在4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆?。新鮮蘋果洗凈，用蘋果切分器將蘋果切成小塊，再將1 mg/mL的供試原液用無菌蒸餾水稀釋成0.25，0.5和0.75 mg/mL的應用液，將切好的蘋果分別放入不同質量濃度羅漢果花提取液中，浸泡3 min，以無菌蒸餾水為對照，取出后晾干水分，裝入PE保鮮袋中，在4 ℃條件下貯藏，分別在第0，第2，第4，第6，第8和第10天測定指標，所有指標重復3次，取平均值[10]。

1.2.5.2 可溶性固形物的測定

使用手持式折光儀進行測定。

1.2.5.3 質量損失率的測定

采用稱量法，以最初蘋果質量與每次測定蘋果質量之差占最初蘋果質量的百分比表示。

式中：m0表示最初蘋果質量，g；m1表示每次測定蘋果質量，g。

1.2.5.4 呼吸強度測定

將裝有0.4 mol/L氫氧化鈉的培養(yǎng)皿置于玻璃干燥器底部，放置隔板，放入處理后的蘋果，封蓋，靜置1 h后，取出培養(yǎng)皿，把氫氧化鈉溶液移入試劑瓶中（沖洗3～5次），每組吸取10 mL至錐形瓶中，加2.5 mL飽和氯化鋇溶液，滴入一滴酚酞指示劑，用0.3 mol/L草酸滴定，記錄消耗的草酸體積，每組2瓶。另吸取10 mL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液至錐形瓶中，加2.5 mL飽和氯化鋇溶液，滴入一滴酚酞指示劑，做空白滴定，記錄消耗的草酸體積，每組一瓶。呼吸強度按式（3）計算：式中：V0表示空白滴定消耗草酸的體積，mL；V1表示測定管消耗草酸體積均值，mL；C表示草酸溶液摩爾濃度，mol/L；M表示樣品質量，kg；h表示測定時間，h；44表示CO2摩爾質量，g。

1.2.5.5 感官評定

按照感官評定的要求，隨機抽取10人，獨立評分，采用多層次綜合評判法對鮮切蘋果的感官質量進行分析[5]。重復3次，取平均值，評定指標見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

依照1.2.3方法進行試驗，提取溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間和料液比對提取液總抗氧化能力的影響結果見圖1。

由圖1（a）可知，總抗氧化能力到40 ℃時最強，為1 345.79 U/g，故40 ℃為最佳提取溫度；由圖1（b）可知，隨著時間的不斷增加，提取液總抗氧化能力也在不斷增加，到120 min時達到最強（1 017.42 U/g）。所以確定120 min為最佳提取時間；由圖1（c）可知，提取液總抗氧化能力隨著料液比逐漸升高而升高，直到料液比為1︰20（g/mL）后趨于平緩，考慮到增大料液比會帶來后續(xù)濃縮工藝的成本，所以確定1︰20（g/mL）為最佳提取料液比；由圖1（d）可知，總抗氧化能力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增加，到80%時達到最高（1 157.46 U/g），隨后立即下降。所以最佳提取乙醇體積分數(shù)為80%。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果分析

在單因素試驗的基礎上，以提取液總抗氧化能力為指標，在提取時間確定為120 min的基礎上，選擇提取溫度、乙醇體積分數(shù)、料液比三個因素進行響應面試驗，最終得出羅漢果花提取液的最佳提取條件。試驗因素水平及編碼見表2，響應面試驗結果見表3。

通過Design Expert 8.0對表2進行回歸數(shù)據(jù)分析，擬合得到乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、溫度（C）的二次多項回歸模型：

總抗氧化能力=1 320.47+52.43A-3.63B+98.88C+102.49AB+32.65AC-20.05BC-140.35A2-232.35B2-112.56C2

對上述回歸模型進行了方差分析，結果見表4。模型項p＜0.001，非常顯著，失擬項p=0.845 1＞0.05，不顯著，模型的相關系數(shù)R2=0.970 6，表明該模型擬合程度好。一次項的F值大小反映因素對響應值的影響程度，F(xiàn)值與各因素對響應值的影響程度成正比[5]。因此，各因素對總抗氧化能力的影響程度次序為提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞料液比。軟件分析得出變異系數(shù)（C.V）4.46%較小，即模型的可靠性高；預測相關系數(shù)R2Pred=0.962 7，調整相關系數(shù)R2Adj=0.932 8，兩者相差較小，表明試驗預測值擬合度較好。回歸模型中的一次項料液比不顯著，二次項乙醇體積分數(shù)非常顯著、料液比極顯著，交互項乙醇體積分數(shù)和溫度、料液比和溫度不顯著，數(shù)據(jù)表明各因素對羅漢果花提取液總抗氧化能力具有顯著的效果，并且不是一般的線性關系[11]。

圖1 單因素試驗結果

表2 試驗因素水平及編碼

表3 響應面優(yōu)化試驗方案及結果

表4 總抗氧化能力方差分析表

2.2.2 各因素之間的交互作用

為進一步考察三個因素中交互作用對羅漢果花提取液總抗氧化能力的影響，用Design Expert 8.0.6軟件繪制的三維曲線圖表示不同因素對于響應值影響，其中AB之間的交互作用對羅漢果花提取液總抗氧化能力影響非常顯著，具體見圖2。響應面圖是每個試驗因素響應值的三維空間曲線圖，表面的幅度越大，則表明對試驗結果的影響越大[11]。等高線圖的形狀則可以反映出各因素效應強弱的大小，橢圓形則這兩個因素之間的相互作用顯著，而圓形則相反[11]。

圖2 料液比和乙醇體積分數(shù)對總抗氧化能力的影響

2.2.3 驗證試驗

利用Design Expert 8.0.6軟件分析并根據(jù)Box-Behnken試驗所得到的結果和二次多項式回歸方程，得到羅漢果花活性物質的最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)81.42%、料液比1︰20.18（g/mL）、提取溫度43.85℃。在此條件下羅漢果花提取液的總抗氧化能力為1 634.16 U/g。為檢驗響應面優(yōu)化結果的可靠性，進行了驗證試驗?？紤]到實際情況，將工藝條件修整為乙醇體積分數(shù)81%、料液比1︰20（g/mL）、溫度44℃，在此條件下進行5次平行驗證試驗，得到羅漢果花提取液總抗氧化能力為1 649.34 U/g，具有0.93%的相對偏差的理論預測。實踐證明采用響應面法所得到的工藝參數(shù)是更可靠的，并具有一定的應用價值。

2.3 提取液對鮮切蘋果的保鮮試驗

2.3.1 不同濃度羅漢果花提取液對鮮切蘋果可溶性固形物含量的影響

按1.2.5的方法進行試驗，可溶性固形物含量的變化見圖3。鮮切蘋果可溶性固形物含量在貯藏期間均呈下降趨勢，到第4天時下降較多，尤其是空白對照組。用不同濃度羅漢果花提取液處理的鮮切蘋果和對照組相比在試驗期間內可溶性固形物的損失均低于空白對照組，且提取液濃度的增大越大，可溶性固形物的損失越小。

圖3 貯藏期間鮮切蘋果可溶性固形物含量的變化

2.3.2 不同濃度羅漢果花提取液對鮮切蘋果質量損失率的影響

按1.2.5的方法進行試驗，鮮切蘋果質量損失率的變化見圖4。鮮切蘋果貯藏期間質量損失率逐漸增加，對照組比3個處理組質量損失率上升明顯。4 d前，3個處理組之間質量損失率差異不明顯；4 d后，3個處理組的質量損失率均低于空白對照組，且差異顯著。在貯藏期內質量損失率與處理液的濃度呈負相關性。

圖4 貯藏期間鮮切蘋果質量損失率的變化

2.3.3 不同濃度羅漢果花提取液對鮮切蘋果呼吸強度的影響

按1.2.5的方法進行試驗，鮮切蘋果呼吸強度的變化見圖5。鮮切蘋果在貯藏過程中呼吸強度均呈先增大后降低的變化趨勢。與空白對照組相比，羅漢果花提取液處理可推遲鮮切蘋果呼吸高峰的到來，其中0.25 mg/mL提取液處理組呼吸高峰推遲了2 d，0.5 mg/mL和0.75 mg/mL提取液處理組則可在貯藏的第8天才達到呼吸高峰，這有利于鮮切蘋果品質的保持，且各處理組的峰值均比對照組低，對照組于貯藏的第2天達到呼吸高峰，峰值為132.0 mg CO2/（kg·h），而0.75 mg/mL羅漢果花提取液處理組此時僅為50 mg CO2/（kg·h），顯著抑制了鮮切蘋果的呼吸強度。

圖5 貯藏期間鮮切蘋果呼吸強度的變化

2.3.4 不同濃度羅漢果花提取液對鮮切蘋果感官品質的影響

隨機抽選10人對不同質量濃度羅漢果花提取液處理的鮮切蘋果進行感官評定，并取平均值，評定結果如表5所示。不同濃度處理的鮮切蘋果其感官評價分值均隨著貯藏時間的延長呈逐漸下降的變化趨勢，處理組均可在不同程度上延緩鮮切蘋果感官評分的下降速度。空白組蘋果在貯藏的第6天出現(xiàn)明顯褐斑，到第8天發(fā)生腐??；0.25 mg/mL處理組在第8天出現(xiàn)少量褐斑；而0.5 mg/mL組和0.75 mg/mL組均在第10天才產生少量褐斑且未發(fā)生腐爛，且0.75 mg/mL組與0.5 mg/mL組相比保鮮效果更好。所以0.75 mg/mL的提取液對蘋果的保鮮效果最好。

表5 鮮切蘋果感官品質評定結果

3 結論

羅漢果花活性物質的最佳提取工藝條件為：提取溫度44 ℃、乙醇體積分數(shù)81%、料液比1︰20（g/mL）、提取時間120 min。在此提取工藝條件下羅漢果花提取液的總抗氧化能力為1 649.34 U/g，與理論預測值的相對偏差為0.93%；不同濃度提取液均可抑制鮮切蘋果的呼吸強度，降低失重率，減少可溶性固形物的損失。其中以0.75 mg/mL提取液保鮮效果較好，與對照組相比，鮮切蘋果保鮮期延長了6 d左右。故響應面法獲得的羅漢果花活性物質提取工藝模型可靠，在實踐中具有可行性，提取液對鮮切蘋果具有一定的保鮮效果。