蔣迪 ，張曉羽 ，奚倩，隋悅 ，白穎 ，啟航 *

1. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（大連 116034）；2. 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心（大連 116034）；3. 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（阿拉爾 843300）

海帶（Laminaria japonica）隸屬于褐藻綱（Phaeophyceae），是海藻中主要的一類(lèi)褐藻。2017年，中國(guó)海帶產(chǎn)量為149萬(wàn) t（干質(zhì)量）[1]，約占世界總產(chǎn)量的1/4。海帶中豐富的海帶多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、褐藻多酚、巖藻黃質(zhì)等成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-5]。豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及風(fēng)味成分是海藻風(fēng)味調(diào)味品的優(yōu)選來(lái)源[6-7]。調(diào)味料產(chǎn)業(yè)表現(xiàn)出日漸多元化、復(fù)合性及高品質(zhì)需求發(fā)展。來(lái)源于海洋動(dòng)物的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，如魚(yú)、蝦、蛤、蟹等副產(chǎn)品，通過(guò)美拉德反應(yīng)，被廣泛用于生產(chǎn)海鮮調(diào)味品[8]。以酶解液作為基料制備的調(diào)味料已經(jīng)成為調(diào)味品行業(yè)的發(fā)展走勢(shì)[9-10]。

Peinado等[11]利用魚(yú)副產(chǎn)品酶解物對(duì)生產(chǎn)海鮮風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示賴(lài)氨酸、谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸的增加使得由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的一些特征類(lèi)化合物發(fā)生變化。王莉嫦等[12]通過(guò)使用蛋白酶來(lái)水解鯪魚(yú)肉以得到水解蛋白，使其與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)以制備出一種肉類(lèi)香精。吳靖娜等[13]選用鮑魚(yú)蒸煮液與木糖進(jìn)行的美拉德反應(yīng)，利用電子鼻技術(shù)對(duì)產(chǎn)物的氣味進(jìn)行分析，研發(fā)一種新型海鮮調(diào)味基料。Cai等[14]將中國(guó)對(duì)蝦廢棄物水解物在存在或不存在木糖的條件下進(jìn)行加熱，結(jié)果顯示，在適當(dāng)?shù)募訜釙r(shí)間下，美拉德反應(yīng)可以對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行改性，呈現(xiàn)出更令人愉悅的風(fēng)味特征，發(fā)現(xiàn)氨基酸和揮發(fā)性化合物反應(yīng)出的濃郁肉香及海鮮的香氣。孫麗平等[10]利用正交試驗(yàn)對(duì)鯉魚(yú)的魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物與葡萄糖發(fā)生的美拉德反應(yīng)進(jìn)行條件篩選，在最適反應(yīng)條件下得到的調(diào)味基料具有的風(fēng)味良好，香氣濃厚且無(wú)明顯魚(yú)腥味的特點(diǎn)。王茵等[15]將花蛤蒸煮液與木糖共同作用發(fā)生美拉德反應(yīng)，利用正交試驗(yàn)對(duì)美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行篩選，開(kāi)發(fā)出一種新型的海鮮調(diào)味料。

以海帶酶解凍干粉為原料，以美拉德反應(yīng)的程度為指標(biāo)，進(jìn)行美拉德反應(yīng)的響應(yīng)面試驗(yàn)，篩選出最佳的美拉德反應(yīng)條件，并在最優(yōu)條件下制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。同時(shí)進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味化合物的鑒定，滋味和風(fēng)味的分析，以期為制備海帶調(diào)味料，提升海帶深加工產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

海帶酶解凍干粉（國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心前期制備品，海帶經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解后凍干品）；乙腈（分析純，美國(guó)SPECTRUM化學(xué)試劑公司）；D-核糖（分析純，上海阿拉丁試劑有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（分析純，上海阿拉丁試劑有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Z 323型冷凍離心機(jī)（賀默（上海）儀器科技有限公司）；EClassical 3100型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；601型電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PHS-3型精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；AB 2004-N型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；7890 B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；TS-5000 Z型電子舌（本Insent公司）日；PEN 33型電子鼻（德國(guó)AIRSENSE公司）。

1.2 方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

分別將0.2 g酶解產(chǎn)物凍干粉充分粉碎后與5 mL蒸餾水混合，將D-核糖以不同濃度（以酶解液干粉質(zhì)量計(jì)）添加至混合液中，調(diào)節(jié)不同pH，在不同反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進(jìn)行凍干后，得到美拉德反應(yīng)調(diào)味料，置于4 ℃條件下備用。

1.2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)程度的檢測(cè)

美拉德反應(yīng)的反應(yīng)過(guò)程有3個(gè)階段，類(lèi)黑素的產(chǎn)生發(fā)生在第3階段[16]，其隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，顏色加深，影響體系的色澤。類(lèi)黑素在420 nm可以被檢測(cè)[17-18]，以420 nm吸光度來(lái)表示其美拉德反應(yīng)的程度。

1.2.3 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

基于前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定D-核糖的最優(yōu)添加條件為：D-核糖濃度20%、反應(yīng)時(shí)間120 min、反應(yīng)溫度120 ℃、pH 12。分別選取3個(gè)獨(dú)立的變量為：D-核糖濃度（x1）、反應(yīng)的時(shí)間（x2）和pH（x3），x1分別為5%，20%和35%；x2分別為60，150和240 min；x3分別為8，11和14。使用3×3的隨機(jī)因子設(shè)計(jì)（CRD）來(lái)獲取x1，x2和x3值的組合。為找到反應(yīng)條件的最適選擇，建立響應(yīng)面的二階多項(xiàng)式模型：y=a11x12+a22x22+a33x32+a12x1x2+a13x1x3+a23x2x3+a1x1+a2x2+a3x3+a0。其中，y表示預(yù)測(cè)的響應(yīng)；x1、x2和x3表示獨(dú)立變量；a0表示偏移項(xiàng)；a1和a2表示線性效應(yīng)；a12表示2個(gè)變量之間的相互作用的效應(yīng)。

1.2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分析

取2 g樣品，裝入帶有螺帽的玻璃容器中，使用氮?dú)馔ㄟ^(guò)懸浮液發(fā)泡，在90 ℃下水浴平衡30 min，使用20 mL/min的恒定氮?dú)饬鞔祾?0 min。將揮發(fā)性化合物收集在含有100 mg Tenax吸附劑的玻璃毛細(xì)管（內(nèi)徑3 mm）中，進(jìn)樣。

升溫程序：初始溫度130 ℃，保持10 min。色譜柱溫度50 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升溫到160 ℃，再以15 ℃/min升溫到320 ℃，保持10 min。載氣為氦氣（He），恒定流速20 mL/min，進(jìn)樣口溫度270 ℃，解吸15 min，壓強(qiáng)100 kPa。在每次分析過(guò)程中，Tenax捕集阱通過(guò)在250 ℃回流1 h進(jìn)行捕集。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線240 ℃，質(zhì)譜掃描范圍29～350 m/z。

將保留時(shí)間和質(zhì)譜與NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)比較，在GC-MS上通過(guò)直接注射分析一系列正構(gòu)烷烴（C8～C20）以獲得保留指數(shù)（RI）值。將RI數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化合物值進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物滋味與風(fēng)味的分析

電子舌滋味的分析采用Wang等[19]的方法進(jìn)行修改。將1 g樣品與40 mL去離子水混合后，室溫下靜置10 min。測(cè)定條件：傳感器清洗時(shí)間20 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間1 s，樣品測(cè)試時(shí)間120 s，將每個(gè)溶液獲得的最后5 s的平均值作為測(cè)定數(shù)據(jù)。為減少測(cè)量誤差提升穩(wěn)定性，每個(gè)方案重復(fù)測(cè)定10次，每個(gè)傳感器的最后3個(gè)測(cè)定值被認(rèn)為是準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，用作后續(xù)分析。

電子鼻風(fēng)味分析采用Yao等[20]的方法。采用靜態(tài)的頂空（HS-100）自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行進(jìn)樣。PEN3電子鼻由10個(gè)傳感器組成，如表1所示。測(cè)定條件：電子頭測(cè)量時(shí)間100 s；頂空溫度25 ℃；內(nèi)部流量300 mL/min；注射流量300 mL/min。每個(gè)樣品重復(fù)2次。所有樣品以7次的重復(fù)進(jìn)行，使用應(yīng)用于電子鼻分析的軟件獲得其雷達(dá)圖。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以多組平行數(shù)據(jù)的平均值表示，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差；利用SPSS軟件采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05表示顯著，p＜0.01表示極顯著。采用Design Expert 10.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最優(yōu)美拉德反應(yīng)條件的確定

根據(jù)前期單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇D-核糖濃度5%，20%和35%，反應(yīng)時(shí)間60，150和240 min，pH 8，11和14，分別為自變量，以420 nm處的吸光度作為因變量，對(duì)其美拉德反應(yīng)進(jìn)行響應(yīng)面分析。通過(guò)3×3的隨機(jī)因子設(shè)計(jì)進(jìn)行17個(gè)試驗(yàn)以?xún)?yōu)化試驗(yàn)中的3個(gè)獨(dú)立的參數(shù)。為評(píng)估模型的顯著性，同時(shí)完成方差分析，以證明給出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與二階多項(xiàng)式方程是否適合。吸光度的結(jié)果如表2所示。

表1 電子鼻傳感器的性能描述

表2 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)結(jié)果

以D-核糖的濃度（x1）、反應(yīng)時(shí)間（x2）、反應(yīng)pH（x3）為自變量，吸光度（y）為因變量以建立的回歸方程為：y=-0.029x12+0.11x22-0.029x32+0.089x1x2+0.032x1x3-0.33x2x3-0.17x1+0.23x2+0.42x3+5.50。

對(duì)吸光度的回歸方程式進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。模型對(duì)試驗(yàn)的擬合情況良好，模型的p=0.034 0＜0.05，表明此試驗(yàn)的模型顯著。失擬項(xiàng)p=0.972 9＞0.05，表明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)并不顯著，方程對(duì)試驗(yàn)的擬合程度較好，該方法為可靠。

表3 吸光度回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

圖1表明3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值有一定影響。如圖1（A）所示，D-核糖濃度的增大同時(shí)伴隨著吸光度的升高。吸光度隨著反應(yīng)時(shí)間增大呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在60～150 min，其增長(zhǎng)趨勢(shì)快速，后趨于平穩(wěn)。pH對(duì)吸光度的影響與其單因素試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)的趨勢(shì)相同，反應(yīng)程度在弱堿性條件下要適于弱堿性環(huán)境。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果分析，選定美拉德反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)條件：D-核糖濃度24.25%、反應(yīng)時(shí)間235.07 min、pH 11.66。此時(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的420 nm處吸光度可達(dá)0.603。在此條件下進(jìn)行3次的平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm處的吸光度為0.597±0.059。Yang等[21]在對(duì)魚(yú)肉美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，選擇D-核糖濃度、反應(yīng)時(shí)間及pH為因素，得到相似結(jié)果，較高的D-核糖濃度與高pH會(huì)造成吸光度在420 nm處增加。

圖1 D-核糖的濃度、反應(yīng)間、pH對(duì)吸光度的影響的響應(yīng)面圖

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

如表4所示，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量最高的化合物為己醛，其含量為33.54%。這與Peinadopardo等[22]報(bào)道的在添加魚(yú)油的酶解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)到己醛的結(jié)果相一致，同時(shí)在小麥的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)到己醛的存在[23]。2-乙酰基-1,4, 5, 6-四氫吡啶含量在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中含量為23.3%，其常被認(rèn)為是產(chǎn)生谷物特征風(fēng)味的重要化合物之一，尤其是在焙烤面包中的香味，具有爆米花與面包皮的香味特征[24]。由于亞油酸的氧化[25]，通常呋喃類(lèi)化合物會(huì)產(chǎn)生油脂香。在大米儲(chǔ)藏期間[26]檢測(cè)到2-戊基呋喃具有煮熟的螃蟹味與龍蝦味。通過(guò)GC-MS對(duì)美拉德后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性風(fēng)味化合物較多，增加更多的海鮮味及堅(jiān)果香味，改善海產(chǎn)品原有的腥味，表明美拉德反應(yīng)是海鮮調(diào)味料加工中一個(gè)去腥增香的有效途徑。

表4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)與含量

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物滋味與風(fēng)味分析

通過(guò)電子舌與電子鼻對(duì)美拉德反應(yīng)前后進(jìn)行滋味與風(fēng)味分析。如圖2（A）所示，經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)后，鮮味和咸味的響應(yīng)值呈現(xiàn)稍微增加趨勢(shì)，而苦味與澀味的響應(yīng)值則顯著下降。表明經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)既可以掩蓋不良味道，也可提高調(diào)味料的香味。這與孫紅梅等[27]探究的雞骨素及其酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電子舌中的試驗(yàn)結(jié)果相似，即美拉德反應(yīng)后的產(chǎn)物具有更多呈味物質(zhì)，更加濃郁。

由圖2（B）可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的整體風(fēng)味呈現(xiàn)大幅提升，其中以電極為R(2)、R(9)、R(7)的提高最顯著，分別提高6.5，3.1和2.9分。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的主要風(fēng)味特點(diǎn)為烤香味，根據(jù)表2中R(2)電極可知，其特征性風(fēng)味成分可能來(lái)自吡嗪、呋喃酮等。其次R(7)、R(9)電極主要對(duì)芳香成分及有機(jī)硫化物敏感。閾值較低的醇類(lèi)化合物中的1-辛烯-3-醇，可與其他物質(zhì)產(chǎn)生風(fēng)味協(xié)同作用，賦予產(chǎn)品焦香與肉香味[28]，使電子鼻的風(fēng)味分析結(jié)果產(chǎn)生明顯增強(qiáng)，這與葉夢(mèng)迪等[29]通過(guò)美拉德反應(yīng)制備蟹味香精的研究結(jié)果相似。因此美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有的谷物、面包香更強(qiáng)，產(chǎn)品風(fēng)味更加濃郁。

圖2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的電子舌、電子的滋味（A）與風(fēng)味（B）分析結(jié)果雷達(dá)圖

3 結(jié)論

美拉德反應(yīng)的最優(yōu)條件為：D-核糖濃度24.25%、反應(yīng)時(shí)間235.07 min、pH 11.66。在此條件下，420 nm處的吸光度可達(dá)0.603。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為己醛、壬醛、2-乙?；?1, 4, 5, 6-四氫吡啶、2-戊基呋喃，其含有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)豐富，增強(qiáng)反應(yīng)產(chǎn)物的堅(jiān)果香味與海鮮味。電子舌與電子鼻分析結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的滋味與風(fēng)味水平均較酶解液有顯著的提升。海帶酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的味道清香濃郁、滋味新鮮，具有極大的應(yīng)用潛力和前景。