趙斌 郭聯(lián)斌 段武瓊

肝細(xì)胞癌的致病因素包括環(huán)境、病毒感染、宿主腫瘤易感性等多種因素，而免疫力是影響宿主腫瘤易感性的重要因素。CD28分子與抗原遞呈細(xì)胞表面的B7家族分子(CD80與CD86)結(jié)合產(chǎn)生的共刺激信號(hào)對(duì)于活化原始T淋巴細(xì)胞起到關(guān)鍵作用，也是機(jī)體抗腫瘤免疫的重要環(huán)節(jié)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)[2]，T細(xì)胞活化會(huì)受到T細(xì)胞表面激活分子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxie T lylnphoeyte assoeiated antigen-4，CTLA-4)的影響。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[3]，CTLA-4可與抗原遞呈細(xì)胞表面的B7家族分子相結(jié)合從而協(xié)同抑制T細(xì)胞增生、活化，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞，使IL-2的產(chǎn)生與T淋巴細(xì)胞活化受到抑制。而CTLA-4與B7家族分子的結(jié)合力遠(yuǎn)高于CD28，是CD28結(jié)合B7分子的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑?，F(xiàn)有證據(jù)表明[4]，CTLA-4基因多態(tài)性具有重要生物學(xué)意義，對(duì)宮頸癌易感性[5]、變應(yīng)性鼻炎[6]遺傳易感性等具有較大關(guān)聯(lián)，但目前有關(guān)CTLA-4與肝癌易感性的研究仍鮮有報(bào)道。本研究對(duì)比肝癌患者與健康體檢者的CTLA-4外顯子49位點(diǎn)的基因型分布，探討CTLA-4與肝癌易感性的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

本院2016年1月—2018年12月共收治70例肝癌患者，均經(jīng)組織活檢、CT或MRI查結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診為肝癌，其中男40例、女30例；年齡39～62歲，平均(52.42±7.67)歲。另選取同期于本院進(jìn)行健康體檢的個(gè)體70例作為對(duì)照，男44例、女26例；年齡34～60歲，平均(50.81±8.20)歲。兩組均排除酒精性/藥物性肝病、自身免疫性肝損害、伴人類免疫缺陷病毒感染者。

二、方法

所有患者均進(jìn)行CTLA-4多態(tài)性檢測(cè)：①提取外周血DNA：采用DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京科恩堡生物科技有限公司)提取外周血白細(xì)胞DNA，置于-20℃下保存。②聚合酶鏈(PCR)反應(yīng)：引物序列49A/G，正向：5′-AATTGGGATTTA-GGAGGACC-3′，反向：′-AATACAGAGCCAGCCAAGCC-3′。擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件：95℃下變性5 min，35個(gè)循環(huán)；95℃下變性30 s，在60℃、58℃、60℃下退火30 s。72℃延伸10 min。擴(kuò)增片段為641和486 bp。③CTLA-4的49A/G位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)法，使用限制性內(nèi)切酶BbvI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，水浴24 h，取4 μL酶切產(chǎn)物，上樣于2%瓊脂糖，電泳分離(120 V、25 min)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

三、觀察指標(biāo)

比較2組的基因型分布(AA、AG、GG)及等位基因A、G頻率，采用Spearman相關(guān)性分析CTLA-4基因多態(tài)性與肝癌易感性的相關(guān)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料的比較采取χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因型分布

兩組AA、AG、GG基因型的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 兩組基因型分布的比較n(%)

二、等位基因頻率

肝癌組G等位基因頻率為71.43%(50/70)，顯著高于對(duì)照組51.43%(36/70)(χ2=5.909，P=0.015，P<0.05)。

三、相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析證實(shí)，CTLA-4基因多態(tài)性與肝癌易感性存在明顯相關(guān)性(r=0.701，P=0.012，P<0.05)，具體表現(xiàn)為攜帶G等位基因會(huì)增加肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)，OR=4.101(2.227～10.031)。

討 論

CTLA-4基因的49位點(diǎn)A/G多態(tài)性已被證實(shí)與多種免疫性疾病有關(guān)，已有證據(jù)表明[7]，CTLA-4基因的49位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)影響乙肝易感性，GG基因型攜帶者感染HBV風(fēng)險(xiǎn)明顯高于其他基因型攜帶者。鑒于以上，有專家推測(cè)[8]，CTLA-4基因的49位點(diǎn)的多態(tài)性也會(huì)影響肝癌易感性。

本研究將肝癌患者與健康對(duì)照者的CTLA-4基因的49位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2組的基因型分布存在顯著差異，具體表現(xiàn)為肝癌組以GG基因型最多見，而正常組則以AG基因型最多見，肝癌組G等位基因頻率為71.43%，高于對(duì)照組51.43%。相關(guān)性分析結(jié)果證實(shí)，CTLA-4基因多態(tài)性與肝癌易感性明顯相關(guān)，攜帶G等位基因患肝癌風(fēng)險(xiǎn)是攜帶A基因的4.101倍。目前研究顯示[9]，CTLA-4基因上存在6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中外顯子1第17密碼子的49位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的生物學(xué)作用最廣泛。CTLA-4外顯子1區(qū)編碼49位點(diǎn)野生型為A等位基因，易突變?yōu)镚等位基因，使該區(qū)編碼的蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，引起蛋白質(zhì)變性，使T細(xì)胞對(duì)CTLA-4分子相關(guān)蛋白的合成和表達(dá)減弱，造成T淋巴細(xì)胞表面的成熟CTLA-4分子減少，產(chǎn)生以下影響：①使T細(xì)胞活化周期停留在G0或G1期，不向S期進(jìn)展，最終導(dǎo)致自身免疫性疾病或腫瘤的發(fā)生。②介導(dǎo)不依賴Fas途徑的T細(xì)胞凋亡，抑制T細(xì)胞分化與增殖，負(fù)性調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，下調(diào)抗腫瘤免疫功能。說明CTLA-4基因多態(tài)性主要是通過A等位基因突變?yōu)镚等位基因而減弱機(jī)體抗腫瘤作用，增加肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而攜帶A等位基因則是降低肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)的有利因素。CTLA-4基因上其他位點(diǎn)如啟動(dòng)子1722位點(diǎn)、啟動(dòng)子1661位點(diǎn)對(duì)肝癌易感性的影響，本研究未能全部納入分析，為不足之處，有待后續(xù)補(bǔ)充報(bào)道。

綜上，CTLA-4基因的外顯子49位點(diǎn)基因多態(tài)性與肝癌易感性存在較大相關(guān)性，攜帶G等位基因的肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更大。