張林，白俐，鄧海娟，黃桑，鄧群，曾昭智

(1.廣州新海醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510300； 2.廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一種病因不明、發(fā)病機(jī)制不清的致死性彌漫性肺間質(zhì)疾病，以各類炎癥細(xì)胞在肺間質(zhì)浸潤(rùn)、纖維母細(xì)胞增生及纖維結(jié)締組織沉積于肺間質(zhì)為特征。IPF患者中位存活時(shí)間2～5年，5年存活率僅為20%[1]，嚴(yán)重危害人類健康。目前臨床針對(duì)IPF的治療尚無特效療法，主要依靠免疫抑制劑治療，但不良反應(yīng)較大，部分患者治療依從性較差，不能從根本上治療該疾病，因此迫切需要尋找治療肺纖維化有效、安全、副作用小的藥物。研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)在IPF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，氧自由基通過參與肺組織細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎因子產(chǎn)生， 影響細(xì)胞免疫活化狀態(tài)和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，從而損傷肺泡上皮細(xì)胞、導(dǎo)致胞外基質(zhì)沉積、引起肺間質(zhì)纖維化，因此，肺纖維化發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)紊亂、抗氧化系統(tǒng)失衡、肺泡上皮細(xì)胞凋亡過度等因素有關(guān)[2-5]。丁苯酞(NBP)是從芹菜籽內(nèi)所提取，通過人工合成而得的消旋類化合物，其結(jié)構(gòu)與天然芹菜籽內(nèi)的左旋芹菜甲素一致。研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞具有抗血小板聚集、促進(jìn)血管生成、改善循環(huán)、減少氧自由基生成、抗凋亡等作用[6-9]，故推測(cè)丁苯酞對(duì)肺纖維化具有一定的治療作用。為此本研究嘗試用丁苯酞對(duì)博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)肺纖維化小鼠模型的治療作用，為肺纖維化的藥物治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

丁苯酞軟膠囊(恩必普有限公司，批號(hào)：118180427)；IL-1β、TNF-α、MDA、SOD ELISA檢測(cè)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)：201905)；硫酸博來霉素(麥克林，批號(hào)：B802467)；中性甲醛溶液(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150722)；PBS磷酸鹽緩沖劑[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，批號(hào)：8118378]；玉米油(麥克林，批號(hào)：201424)；生理鹽水(廣東科倫藥業(yè)，批號(hào)：H18091601)。

1.2 主要儀器

FA2004B電子天平(上海精科天美)；HZT-A1000電子天平(廈門華志)；TC-120C++智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北泰維)；TB-718L生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(湖北泰維)；生物組織全自動(dòng)染色機(jī)，TR-180Ⅰ(湖北泰維)；RM2235切片機(jī)(德國(guó)徠卡)；AE2000倒置顯微鏡(廈門麥克奧迪)；HCP246恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert)；3K15冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA)；Infinite 200 pro酶標(biāo)儀(瑞士tecan)；Forma 902超低溫冰箱(美國(guó)Thermo)；LUK1801005自動(dòng)樣品快速研磨儀(廣州露卡)；移液槍(Genex Beta)；JY92-IIN超聲儀(寧波新芝)；DHG鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007。實(shí)驗(yàn)期動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2017-0125。

2 方法

2.1 肺纖維化小鼠模型的建立[10]

C57BL/6小鼠腹腔注射硫酸博來霉素35 mg/kg(硫酸博來霉素用生理鹽水溶解)，1周2次，連續(xù)注射8次，建立肺纖維化小鼠模型。

2.2 分組及給藥

取同批24只正常小鼠作為正常對(duì)照組；選取建模成功的小鼠48只，隨機(jī)分成模型組和丁苯酞治療組各2組，每組動(dòng)物12只， 正常對(duì)照組和模型組灌胃實(shí)驗(yàn)專用玉米油10 mL/kg，丁苯酞治療組灌胃丁苯酞180 mg/kg(根據(jù)臨床用藥折算)，每天1次，分別連續(xù)14 d和28 d，丁苯酞用實(shí)驗(yàn)專用玉米油稀釋混懸。分別于末次給藥24 h后處死對(duì)應(yīng)各組小鼠12只進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 小鼠體質(zhì)量測(cè)定 給藥前和末次給藥24 h后進(jìn)行小鼠體質(zhì)量測(cè)定。

2.3.2 肺指數(shù)測(cè)定 分別于末次給藥24 h后取各組小鼠全肺稱質(zhì)量，并按如下公式計(jì)算肺指數(shù):肺指數(shù)=肺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.3.3 肺濕/干質(zhì)量測(cè)定 取左肺稱質(zhì)量，置烘箱60 ℃烘72 h，再次稱質(zhì)量，進(jìn)行濕/干質(zhì)量比計(jì)算，以此判別大鼠肺部的水腫程度。

2.3.4 肺組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià) 給藥14 d和28 d各組小鼠的右肺上葉經(jīng)10%(φ)甲醛溶液固定，按常規(guī)方法制作石蠟病理切片，染色鏡檢。每只小鼠病理切片隨機(jī)選擇1個(gè)觀察視野，根據(jù)Hubner等[11]的方法對(duì)肺纖維化程度進(jìn)行評(píng)分。0分：無纖維化，肺泡結(jié)構(gòu)正常；1分：散在輕度纖維化灶，肺泡間隔厚度≤3倍正常值，部分肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄，但無成團(tuán)肺纖維化；2分：明顯的肺纖維化改變，肺泡間隔厚度>3倍正常值，并伴有繩結(jié)樣改變，但病變未融合，部分肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄，但無成團(tuán)肺纖維化；3分：連續(xù)肺纖維化，肺泡間隔厚度>3倍正常值，部分肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄；4分：?jiǎn)蝹€(gè)成團(tuán)肺纖維化灶，病灶范圍<10%視野；5分：融合成團(tuán)肺纖維化灶，病灶范圍10%～50%視野，肺形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損但還能依稀可見；6分：大片融合成團(tuán)肺纖維化灶，病灶范圍>50%視野，大部分肺泡間隔消失，大部分肺結(jié)構(gòu)毀損；7分：肺泡內(nèi)幾乎充滿成片的纖維組織，肺泡間隔消失，但仍可見至少5個(gè)氣泡樣改變；8分：滿視野成團(tuán)的纖維組織。

2.3.5 血清IL-1β、TNF-α含量測(cè)定 分別于給藥14 d和28 d后小鼠眼眶靜脈采血，2 000 r/min離心10 min取血清，ELISA 法測(cè)定IL-1β、TNF-α水平，含量測(cè)定步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。

2.3.6 肺組織中MDA、SOD含量測(cè)定 分別于給藥14 d和28 d后處死小鼠取右肺下葉，按照一定的比例加入PBS制成10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min取上清液測(cè)定肺組織中MDA、SOD的含量，含量測(cè)定步驟按照ELISA 試劑盒說明書操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠體質(zhì)量的影響

與模型組比較，正常對(duì)照組、丁苯酞治療組小鼠在給藥14 d和28 d后其體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

3.2 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺指數(shù)的影響

與模型組比較，正常對(duì)照組在給藥14 d和28 d后其肺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而丁苯酞治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)，提示丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺指數(shù)無明顯影響。

3.3 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠濕/干質(zhì)量比的影響

與模型組比較，正常對(duì)照組給藥14 d后的左肺濕質(zhì)量、左肺干質(zhì)量和給藥28 d后的左肺干質(zhì)量、肺濕/干質(zhì)量比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而丁苯酞治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)，提示丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠濕/干質(zhì)量比無明顯影響。

表1 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of butylphthalide on the weight in mice with pulmonary fibrosis

表2 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺指數(shù)的影響Table 2 Effect of butylphthalide on the lung index in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01。

表3 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠濕/干質(zhì)量比的影響Table 3 Effect of butylphthalide on the wet/dry ratio in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01，*P<0.05。

3.4 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

肉眼可見，模型組小鼠雙肺體積明顯增大、充血水腫、肺外周可見片狀出血。經(jīng)丁苯酞治療后，肺表面血紅色區(qū)減少，水腫和充血大部分消失，接近正常組。光鏡下正常組肺泡腔完好，肺泡腔內(nèi)無分泌物，幾乎無肺水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，支氣管上皮無變形和管周炎，無纖維化。模型組肺泡腔消失，肺泡腔內(nèi)有漿液性滲出物及大量炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔厚度增加和肺纖維化明顯。丁苯酞治療后，支氣管變形等現(xiàn)象明顯減輕或者消失，肺泡炎癥細(xì)胞和肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞明顯減少，纖維化明顯減輕，見圖1。與模型組相比，丁苯酞治療組給藥14 d和28 d后其肺纖維化程度均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

A.正常對(duì)照組(給藥14 d); B.模型組(給藥14 d); C.丁苯酞治療組(給藥14 d); D.正常對(duì)照組(給藥28 d); E.模型組(給藥28 d); F.丁苯酞治療組(給藥28 d)

圖1丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺組織病理學(xué)影響

Figure1Effect of butylphthalide on the lung histopathology in mice with pulmonary fibrosis (HE,100×)

3.5 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影響

與模型組相比，正常對(duì)照組和丁苯酞治療組給藥14 d和28 d后小鼠血清的IL-1β和TNF-α水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；丁苯酞治療給藥28 d小鼠血清的IL-1β水平明顯低于14 d的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

表4 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺纖維化程度評(píng)分的影響

組別劑量/(mg·kg-1)肺纖維化/分給藥14 d給藥28 d正常對(duì)照組-0.58±0.67??0.67±0.65??模型組-3.17±1.112.92±1.00丁苯酞治療組1801.75±0.62??1.67±0.65??

與模型組比較:**P<0.01。

3.6 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中MDA和SOD含量的影響

與模型組相比，正常對(duì)照組和丁苯酞治療組給藥14 d和28 d后小鼠肺組織中MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；丁苯酞治療給藥28 d小鼠肺組織中SOD含量明顯高于14 d的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表6。

4 討論

理想的肺纖維化動(dòng)物模型必須能復(fù)制典型普通型間質(zhì)性肺炎的組織學(xué)特征，肺纖維化持續(xù)或不可逆進(jìn)展。博來霉素獲取途徑便利、可重復(fù)性強(qiáng)，成為目前最常用的誘導(dǎo)肺纖維化的藥物[10]；C57BL/6小鼠對(duì)博來霉素最敏感，是目前最常用的肺纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過腹腔注射博來霉素建立穩(wěn)定的C57BL/6小鼠肺纖維化模型，該方法操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，成模時(shí)間短，病理及相關(guān)細(xì)胞因子的改變與人類IPF類似[10，12-14]。本實(shí)驗(yàn)中小鼠連續(xù)注射博來霉素8次后出現(xiàn)肺充血水腫、炎癥細(xì)胞，肺泡間隔厚度增加，纖維化明顯等癥狀，表明博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠造模成功。經(jīng)丁苯酞治療后，肺水腫現(xiàn)象明顯減輕，炎癥細(xì)胞明顯減少，纖維化癥狀減輕，肺纖維化程度評(píng)分分值明顯降低，表明丁苯酞能減輕肺纖維化小鼠肺部病變，降低纖維化程度，對(duì)其有一定治療作用。

表5 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影響Table 5 Effect of butylphthalide on the levels of blood IL-1β and TNF-α in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01；與給藥14 d對(duì)應(yīng)指標(biāo)比較：##P<0.01。

表6 丁苯酞對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中MDA和SOD含量的影響Table 6 Effect of butylphthalide on the levels of MDA and SOD in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01；與給藥14 d對(duì)應(yīng)指標(biāo)比較：##P<0.01。

炎癥反應(yīng)在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義，IL-1β、TNF-α因子介導(dǎo)造成肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞的損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺纖維化小鼠模型中IL-1β和TNF-α大量表達(dá)，表明小鼠肺纖維化與炎性因子釋放表達(dá)有關(guān)，經(jīng)過丁苯酞治療后IL-1β和TNF-α水平明顯下降，這與其他文獻(xiàn)研究結(jié)果相符[15-16]，提示丁苯酞可能通過降低血清中的IL-1β和TNF-α炎癥因子產(chǎn)生，減輕肺纖維化小鼠的炎性反應(yīng)，阻礙或者延緩肺水腫和纖維化的形成，從而達(dá)到對(duì)肺纖維化小鼠模型的治療作用，但其具體通過何種調(diào)節(jié)機(jī)制和信號(hào)通路來達(dá)到干預(yù)保護(hù)作用，有待于后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。給藥28 d小鼠血清的IL-1β水平明顯低于14 d的水平，表明丁苯酞治療28 d比治療14 d更能達(dá)到控制炎癥因子的水平。

博來霉素通過與金屬離子螯合作用后使氧分子生成氧自由基，最終導(dǎo)致過氧化物的大量生成，過氧化物在肺纖維化形成中起到了重要的作用，機(jī)體在正常情況下，氧化和抗氧化作用處于動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)機(jī)體遭受氧化應(yīng)激時(shí)，脂質(zhì)過氧化物MDA的含量將明顯增加，而抗氧化物如SOD水平明顯降低[13，17]。本研究表明，丁苯酞應(yīng)用后小鼠肺組織中MDA的含量明顯降低，SOD水平明顯提高，說明丁苯酞可能有助于對(duì)氧自由基的清除，因此推測(cè)丁苯酞對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用與其增加肺臟中的抗氧化能力有關(guān)，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待于后期進(jìn)一步研究。丁苯酞治療給藥28 d小鼠肺組織中SOD含量明顯高于14 d的水平，說明給藥28 d小鼠肺臟中的抗氧化能力強(qiáng)于給藥14 d的抗氧化能力，表明丁苯酞治療28 d的抗氧化效果好。

綜上所述，丁苯酞可通過降低血清中炎癥因子的產(chǎn)生和增強(qiáng)肺組織的抗氧化能力，阻礙或者延緩肺水腫和纖維化的形成，從而達(dá)到對(duì)肺纖維化小鼠模型的治療作用，且治療給藥28 d的效果好。