桑延霞，張軍軍

(廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院,廣東 廣州 510006)

全球約4.24億人患有糖尿病，其中90%～95%患者為2型糖尿病[1]，建立2型糖尿病動(dòng)物模型是篩選糖尿病藥物及深入研究2型糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)。目前，2型糖尿病大鼠建模方法主要有化學(xué)試劑誘發(fā)、自發(fā)性篩選、轉(zhuǎn)基因和基因敲除、特殊膳食誘導(dǎo)等[2-5]。單一化學(xué)試劑誘發(fā)法對(duì)劑量把控要求較高，劑量過低，不易成模，劑量過高，死亡率大[6-8]，易導(dǎo)致1型糖尿病。膳食誘導(dǎo)，耗時(shí)長(zhǎng)，淘汰率高，造模成本高[9-11]。基因改造方法技術(shù)難度高，耗資大[12- 13]。目前多采用膳食誘導(dǎo)輔以低劑量STZ誘導(dǎo)構(gòu)建2型糖尿病模型，但模型構(gòu)建也受動(dòng)物種類、年齡、性別、飲食、飼養(yǎng)環(huán)境、誘變劑量、禁食狀態(tài)、誘導(dǎo)后的飲食狀況等很多因素的影響[14-17]。本研究充分考慮了上述因素的影響，利用高糖高脂飲食誘發(fā)大鼠外周胰島素抵抗，再以不同劑量的STZ誘導(dǎo)胰島細(xì)胞的凋亡，最終建立一種符合2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

Elx800 酶標(biāo)儀(Bio Tek)；微量血糖測(cè)定儀(Onetouch Ultra，Johnson)；ME104 電子天平(Mettler Toledo)。

1.2 試劑

STZ(Sigma公司)；胰島素檢測(cè)試劑盒(Blue gene公司，上海)；高糖高脂飼料(蔗糖20%+豬油10%+膽固醇2.5%+膽酸鈉1% ，其余為維持料，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；真空采血管(滄州永康醫(yī)藥用品有限公司)；葡萄糖、檸檬酸鈉、乙醚均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，4～5周齡，體質(zhì)量90～100 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0002。

2 方法

2.1 模型的建立

喂養(yǎng)8周后，于注射STZ前2天，白天禁食16 h，測(cè)FPG、空腹胰島素(FINS)?；謴?fù)正常飲食2 d，測(cè)定口服糖耐量(OGTT)。正常飲食2 d后，白天禁食16 h，稱量體質(zhì)量，L組、H組分別以30、60 mg/kg的劑量一次性腹腔注射用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.4)配制的0.5%STZ，Control組注射1 mL的檸檬酸緩沖液，注射1 h后給食和0.5%的葡萄糖水。STZ誘導(dǎo)2周后，白天禁食16 h，測(cè)定體質(zhì)量、FBG、FINS?；謴?fù)休養(yǎng)2 d后，測(cè)定OGTT。

2.2 FINS的測(cè)定

大鼠乙醚麻醉后，眼叢靜脈取血，1 000g離心10 min，取上清，按試劑盒說明書測(cè)定血清胰島素含量。

2.3 OGTT實(shí)驗(yàn)

STZ誘導(dǎo)2周后，全部大鼠白天禁食16 h后，將20%的葡萄糖溶液以2 g/kg的劑量灌胃，期間可自由進(jìn)水，分別在0 min(給糖前)，給糖后30、60、120、180 min尾靜脈采血測(cè)定血糖，繪制血糖-時(shí)間曲線，利用梯形法計(jì)算給糖2 h內(nèi)血糖曲線下面積(GAUC)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量的變化

********#ControlLH48043038033028023018013080體質(zhì)量/g0周4周8周10周

與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與低劑量STZ組比較：#P<0.05。

圖1各組大鼠體質(zhì)量的變化
Figure1Changes of body weight of rats in each group

3.2 各組大鼠FBG的變化

由圖2可以看出，STZ注射前的8周內(nèi)，各組間FBG差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且都在正常范圍內(nèi)，第10周(STZ注射后2周)時(shí)，L、H組FBG顯著高于Control組(P<0.01)，分別為9.8、13.9 mmol/L，且H組也明顯高于L組(P<0.05)，表明STZ對(duì)胰腺細(xì)胞造成了一定的損傷，導(dǎo)致血糖代謝異常。

181614121086420c(FBG)/(mmol?L-1)注射STZ****#ControlLH101202468t/周

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與低劑量STZ組比較：#P<0.05 。

圖2各組大鼠FBG的變化

Figure2Changes of fasting blood glucose of rats in each group

3.3 各組大鼠FINS的變化

由圖3可以看出，高糖高脂誘導(dǎo)4周后，各組FINS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第8周，L、H組FINS水平明顯高于Control(P<0.05)，出現(xiàn)高胰島素血癥。第10周(STZ注射2周后)，L、H組FINS水平較第8周顯著下降(P<0.01)，但L組仍高于Control(P<0.05)，繼續(xù)維持高胰島素血癥，而H組則低于Control(P<0.05)，出現(xiàn)低胰島素血癥，表明L、H組大鼠胰島細(xì)胞受到了不同程度的損傷，且對(duì)STZ具有劑量依賴性。

##***10周8周4周ControlLH*5045403530252015100ρ(FINS)/(mU?L-1)**

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與低劑量STZ組比較：##P<0.01。

圖3各組大鼠FINS的變化
Figure3Changes of fasting insulin of rats in each group

3.4 各組大鼠糖耐受的變化

圖4第8周的OGTT顯示，僅在給糖后第1小時(shí)，L、H組與Control組血糖的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5第10周OGTT顯示，經(jīng)STZ誘導(dǎo)后，L、H組在各采血點(diǎn)的血糖均顯著高于Control(P<0.01)，且H明顯高于L(P<0.05)。圖6表明，第8周L、H組2 h血糖曲線下面積AUC都顯著高于Control(P<0.05)，預(yù)示高糖高脂誘導(dǎo)使大鼠出現(xiàn)了一定程度的糖耐量受損；第10周L、H組的GAUC均明顯高于第8周(P<0.01)，表明注射STZ后各組糖耐受的損傷加重。

**20181614121086420c(血糖)/(mmol?L-1)ControlLH100150200500t/min

與對(duì)照組比較：*P<0.05。

圖4第8周時(shí)各組大鼠的OGTT (STZ注射前)

Figure4OGTT of rats in each group at 8 weeks (before STZ injection)

****#********#**#**#**#**35302520151050100150200500t/minControlLHc(血糖)/(mmol?L-1)

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與低劑量STZ組比較：#P<0.05。

圖5第10周時(shí)各組大鼠的OGTT (STZ注射后2周)

Figure5OGTT of rats in each group at 10 weeks (2 weeks after STZ injection)

ControlLH**#**6050403020100GAUC10周8周**#

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與8周時(shí)比較：**P<0.01；與低劑量STZ組比較：#P<0.05。

圖6各組大鼠OGTT 2 h內(nèi)GAUC(STZ注射后2周)

Figure6GAUC within 2 hours of OGTT in rats of each group (2weeks after STZ injection)

4 討論

高熱量飲食導(dǎo)致的肥胖使機(jī)體對(duì)胰島素促進(jìn)的葡萄糖攝取效率下降，機(jī)體代償性分泌過多胰島素產(chǎn)生胰島素抵抗[22-23]，同時(shí)糖毒性和脂毒性影響胰島β細(xì)胞功能，造成胰島素分泌障礙，最終形成2型糖尿病。

胰島素抵抗和胰島功能受損是2型糖尿病的典型病理生理特征[24]，高熱量飲食僅能誘導(dǎo)約50%的大鼠發(fā)生胰島素抵抗，若用全部高熱量飲食的大鼠進(jìn)行STZ造模，必定有部分糖尿病大鼠無(wú)胰島素抵抗而更類似1型糖尿病。因此本研究對(duì)4月齡雄鼠進(jìn)行高糖高脂飲食誘導(dǎo)后，剔除食源誘導(dǎo)肥胖抵抗大鼠，選出有胰島素抵抗的食源性肥胖大鼠，再進(jìn)行STZ誘導(dǎo)，使模型更符合2型糖尿病的病理生理機(jī)制。本研究中，高糖高脂飲食8周大鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗，但血糖仍維持在正常水平，具有了早期糖尿病的特征。

腹腔注射不同劑量STZ后，胰島細(xì)胞受到不同程度的損傷，60 mg/kg高劑量STZ嚴(yán)重導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能性障礙，胰島素分泌不足，致使血糖升高，糖耐量下降，體質(zhì)量減輕，表現(xiàn)出1型糖尿病和晚期2型糖尿病的癥狀。30 mg/kg低劑量STZ對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷較輕，胰島素分泌能力雖然有所下降，但血漿胰島素仍顯著高于對(duì)照組，繼續(xù)保持胰島素抵抗的癥狀，同時(shí)胰島損致使血糖升高，達(dá)到糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，使大鼠模型表現(xiàn)出早中期2型糖尿病的典型特征。

在2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建中，動(dòng)物性別、月齡、食源、造模方法等是影響模型成功率的主要因素。與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的不同[6,9,15,21]，本研究使用4月齡雄鼠，縮短了造模時(shí)間，減少了內(nèi)源性激素的干擾；遵循大鼠晝的生活習(xí)性，采用白天禁食的方式，同時(shí)注射STZ后及時(shí)給予低濃度葡萄糖水，避免低血糖造成的死亡，以上措施使成模率達(dá)到64%。

本研究表明，高熱量飲食輔以60 mg/kg STZ誘導(dǎo)4月齡雄性大鼠易致1型糖尿病和晚期2型糖尿??；高熱量飲食輔以30 mg/kg STZ誘導(dǎo)能更快形成具胰島素抵抗的早中期2型糖尿病，并能提高成模率。