馮西婭，黃威，索化夷，王洪偉，張玉*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400700)2(食品科學(xué)與工程國家級教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400700)3(重慶文理學(xué)院，重慶，402160)

牡丹籽油是以油用牡丹籽為原料，經(jīng)壓榨、精制等工藝制成黃色透明油狀液體[1]。牡丹籽油含有豐富的不飽和脂肪酸，具有抗氧化、降低血糖血脂、防癌抗癌、調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、保護(hù)肝臟等作用[2-4]。牡丹籽油中富含亞麻酸(約40 g/100 g)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過橄欖油(約0.5 g/100 g)、菜籽油(約8.5 g/100 g)等植物油，有研究表明，α-亞麻酸對血脂成分、花生酸合成、免疫功能異常、心血管健康、脂類代謝的基因異常、精神障礙、細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)和基因表達(dá)等均有重要影響[5-7]。α-亞麻酸的缺乏是導(dǎo)致老年癡呆、心腦血管疾病、高血壓、高脂血癥和糖尿病、癌癥等疾病的重要誘因，可見牡丹籽油是一種很有開發(fā)前景的植物油[8-11]。

甘油三酯是由1個甘油分子和3個脂肪酸分子生成，天然甘油三酯很少含有3個相同的?；舅?，一般是由多種不同的脂肪酸組成。國外研究表明，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布對于脂肪營養(yǎng)是一個重要的影響因子，決定著甘油三酯的吸收代謝過程及油脂的應(yīng)用價值[12-14]。故而分析牡丹籽油甘油三酯結(jié)構(gòu)對牡丹籽油對人體的保健功能研究有參考作用。拉曼光譜對有機(jī)酸分子具有很好的指紋特性，有快速高效、無污染、無損分析等優(yōu)點(diǎn)，且其特征峰對應(yīng)于有機(jī)分子的官能團(tuán)，能精確反映官能團(tuán)的濃度[15]。相比紅外、紫外、熒光、近紅外等光譜分析方法，拉曼光譜應(yīng)用領(lǐng)域更廣、檢測范圍更寬、靈敏度更高、更快速，無污染[16]。食用油的拉曼光譜信息非常豐富，油脂結(jié)構(gòu)中占有較大比重的不飽和鍵對拉曼光譜中的分子振動有較大貢獻(xiàn)，其信息可于拉曼光譜中清晰表達(dá)[17]。

本實(shí)驗(yàn)在分析牡丹籽毛油基本理化特性的同時選用胰脂肪酶對甘油三酯Sn-1,3位進(jìn)行專一性水解，將Sn-1,3位置上的脂肪酸游離出來，通過薄層層析分離可得到單甘脂。甲酯化后經(jīng)氣相色譜分析可知Sn-2位脂肪酸組成，利用1,3-隨機(jī)-2-隨機(jī)分布學(xué)說可計算出甘油三酯組成[18-20]。利用拉曼光譜測試牡丹籽毛油拉曼光譜特征，分析其分子的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，以期為牡丹籽油的營養(yǎng)學(xué)深入研究和產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘鳳丹’牡丹籽，山東菏澤油用牡丹產(chǎn)業(yè)基地；37種C4-C24脂肪酸甲酯混標(biāo)(產(chǎn)品編號：18919-1AMP | SUPELCO)，sigma-aldrich公司；豬胰脂肪酶(30 000 u/g，生物試劑純)，上海騰準(zhǔn)生物科技有限公司；膽酸鈉(分析純)、柱層析硅膠(100～200目，化學(xué)純)，重慶市鈦新化工有限公司；其他實(shí)驗(yàn)室常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀(配有氫火焰檢測器(FID)，日本島津公司；激光顯微拉曼光譜儀，英國Renishaw公司；SB-3200DTDN型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；1580型離心機(jī)，Gene有限公司；6YZ-160型榨油機(jī)，上海亞榮生化儀器廠；GF254高效薄層層析硅膠板(20 cm×20 cm)，北京貝洛生物科技有限公司；硅膠柱(柱長30 cm，內(nèi)徑2 cm)，重慶市鈦新化工有限公司；薄層色譜展開缸(200 mm×200 mm)，上海信誼儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 校準(zhǔn)曲線的制作

外標(biāo)溶液的配制：將8.2 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶于2 mLV(石油醚)∶V(乙醚)=1∶1溶劑中，稀釋成質(zhì)量濃度為4.1 g/L的溶液；將此母液依次稀釋為2.05、1.03、0.51、0.26 g/L的混標(biāo)溶液。將各濃度溶液經(jīng)氣相色譜法分析，對照說明書，計算各脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)。

氣相色譜儀條件：檢測器：火焰離子檢測器(FID)；色譜柱：DB-WAX(30 m×0.246 mm×0.25 mm)；升溫程序：185 ℃保持 3min；氣化室250 ℃；進(jìn)樣溫度250 ℃；載氣：高純氦氣(60 mL/min)，氫氣(40 mL/min)，空氣(400 mL/min)；進(jìn)樣(1 μL)。

1.3.2 牡丹籽毛油提取

預(yù)熱榨油機(jī)10 min，稱取顆粒飽滿牡丹籽40 g，分批數(shù)次放入榨油機(jī)，初榨油置于離心機(jī)5 000 r/min離心10 min，吸取上層油樣用于后續(xù)分析使用。

1.3.3 牡丹籽毛油理化指標(biāo)測定

酸價參照GB 5009.229—2016 執(zhí)行;皂化值按照GB/T5534—20088 執(zhí)行;過氧化值參照GB 5009.227—2016 執(zhí)行;碘價參照GB/T 5532—2008 執(zhí)行。

1.3.4 牡丹籽油甘油三酯制備

采用硅膠柱分離法：硅膠30 g，用石油醚調(diào)成糊狀填充層析柱。取油樣1 g，溶于15 mL三氯甲烷，加入層析柱，然后用300 mL洗脫液V(石油醚)∶V(乙醚)=9∶1洗脫，流速1～1.5 mL/min。收集液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得純甘三酯，供氣相色譜分析使用。

1.3.5 牡丹籽毛油脂肪酸組成測定

參考并改進(jìn)室溫甲酯化方法[21]。取80 mg牡丹籽毛油，裝入5 mL離心管，加V(石油醚)∶V(乙醚)=1∶1混合溶液2 mL，稍適振搖，放置40 min。再加1 mL KOH-甲醇(0.4 moL/L)溶液混勻，靜置30 min。沿瓶壁加入1 mL蒸餾水，靜置，待分層后，上機(jī)檢測。

1.3.6 胰脂肪酶水解牡丹籽油甘油三酯

稱取0.1 g純化過的甘油三酯于50 mL離心管中，加入胰脂肪酶100 mg及Tris-HCl緩沖液(pH 8)4 mL，搖勻；依次加入1 mL 2 g/L的膽酸鈉溶液及0.4 mL 220 g/L的CaCl2溶液，搖勻，后置于40 ℃的恒溫水浴鍋7 min,并不斷搖動；在40 ℃，18 KHz，80 W超聲波清洗機(jī)中超聲12 min，加入6 mol/L的HCl 3 mL并搖勻，加入10 mLV(正己烷)∶V(異丙醇)=9∶1混合液，搖勻，吸取上清液[22]。經(jīng)薄層層析分離，確定甘一酯帶并刮下，用乙醚提取甘一酯后除去溶劑，對甘一酯進(jìn)行甲酯化后經(jīng)氣相色譜分析Sn-2位脂肪酸組成及含量。利用1，3-隨機(jī)-2-隨機(jī)分布學(xué)說計算甘油三酯的構(gòu)成及含量[23]。

1.3.7 牡丹籽油拉曼光譜分析

儀器預(yù)熱穩(wěn)定后，將牡丹籽油樣不經(jīng)任何化學(xué)預(yù)處理，放入專用液體樣品池。

拉曼光譜測定條件：激光波長：785 nm，光柵：400刻線/mm，光闌：50 μm狹縫，激光能量：10.0 mW；曝光時間：1.00 s，曝光次數(shù)：30，背景曝光次數(shù)：512，物鏡：10×。

1.3.8 甘油三酯分布與組成的計算

根據(jù)牡丹籽油立體專一分布，由Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸組成分析數(shù)據(jù)，采用1,3-隨機(jī)-2-隨機(jī)分布學(xué)說計算各甘三酯組分的含量，如公式(1)所示:

Sn-XYZ/%=R1×R2×R3×10-4

(1)

式中：R1，X酸在Sn-1,3 位的百分含量，%；R2，Y酸在Sn-2位的百分含量，%；R，Z酸在Sn-1,3位的百分含量，%。

如果油脂中含有n種脂肪酸，理論上可以生成n3種甘油三酯。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡丹籽毛油的理化指標(biāo)

根據(jù)1.3.3 提供的方法測定牡丹籽油的理化特性指標(biāo)。如表1所示，牡丹籽油的酸值為(3.54±0.19) mg/g，過氧化值為(0. 19±0.01) g/100 g，符合國標(biāo)對植物原油的規(guī)定[24]。牡丹籽油皂化值較高，說明牡丹籽油脂肪酸分子量小，易吸收；碘值為(161.80±2.65) g/100 g，說明油的不飽和程度很高，牡丹籽油易被氧化，應(yīng)注意貯藏條件[25]。

表1 牡丹籽毛油的理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indexes of crude oil ofpeony seed

2.2 甘油三酯脂肪酸組成的定性與定量分析

將牡丹籽油甘三酯樣品甲酯化處理，再進(jìn)行氣相色譜分析，所得色譜圖見圖1。

a-37種脂肪酸甲酯氣相色譜圖;b-牡丹籽油脂肪酸組成氣相色譜圖圖1 牡丹籽油脂肪酸組成定性分析Fig.1 Qualitative analysis of fatty acid composition ofpeony seed oil

所得圖譜結(jié)合37種脂肪酸甲酯標(biāo)樣的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)曲線定性定量，并將脂肪酸甲酯對照換算系數(shù)換算為脂肪酸含量，結(jié)果如表2所示[26]。此品種牡丹籽毛油的脂肪酸總含量為(89.73±1.89) g/100 g，總不飽和脂肪酸為(77.51±1.51) g/100 g。其主要脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其中三不飽和脂肪酸亞麻酸的含量高達(dá)(40.33±1.01) g/100 g，遠(yuǎn)高于橄欖油[(0.34g±0.01) g/100 g]及葡萄籽油[(0.21±0.01) g/100 g]等植物油[27-28]。有研究表明，人體每天需攝取6 g亞油酸，牡丹籽油甘三酯中含人體必需脂肪酸亞油酸，其含量為(21.08±0.61) g/100 g[29]。可見牡丹籽油是一種富含亞麻酸，亞油酸的植物油，可以維持人體正常生理代謝。

表2 牡丹籽油脂肪酸組成及定量分析Table 2 Fatty acid composition and quantitative analysis ofpeony seed oil glycerin three fat

2.3 牡丹籽油甘油三酯結(jié)構(gòu)分析

利用氣相色譜法分析牡丹籽油甘三酯的總脂肪酸組成及其Sn-2位脂肪酸組成，根據(jù)脂肪酸甲酯標(biāo)樣定性，峰面積歸一法定量，得到牡丹籽油的總脂肪酸及Sn-2位脂肪酸含量，所得氣相色譜見圖2，并采用1,3-隨機(jī)-2-隨機(jī)分布學(xué)說計算出甘三酯中Sn-1位、Sn-2位、Sn-3位脂肪酸組成分布，結(jié)果見表3。根據(jù)牡丹籽油立體專一分布，由Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸組成分析數(shù)據(jù)，采用1,3-隨機(jī)-2-隨機(jī)分布學(xué)說計算牡丹籽油主要甘三酯組分的含量，結(jié)果見表4。

由豬胰脂酶水解法測定的牡丹籽油Sn-2位脂肪酸分布表明：Sn-2位脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸組成，其中油酸含量最高，相對百分含量為(48.06±1.41)%，其次為亞油酸，為(24.07±0.63)%，亞麻酸(23.11±0.57)%。研究表明，Sn-2位脂肪酸直接以單甘酯的形式在小腸吸收，吸收效率大于Sn-1,3位脂肪酸。

結(jié)合表3及表4可知，牡丹籽油甘油三酯中有79%的油酸在Sn-2位置，這說明牡丹籽油中的油酸主要選擇性地與Sn-2結(jié)合，Sn-2位油酸以單甘油酯的形式在體內(nèi)被很好地吸收。13.0%的棕櫚酸在牡丹籽油的甘油三酯Sn-2位置。22.0%的硬脂酸在牡丹籽油的甘油三酯Sn-2位置，這表明飽和脂肪酸牡丹籽油通常有選擇性地酯化于Sn-1, 3位。牡丹籽油甘油三酯中有29.03%的亞油酸位于Sn-2位，17.25%的α-亞麻酸酯化在Sn-2位，這表明大多數(shù)亞油酸和α-亞麻酸酸選擇性地結(jié)合到Sn-1,3位。這兩種多不飽和脂肪酸比油酸更容易氧化，其高含量使牡丹籽油更容易氧化變質(zhì)，這個分布不利于保護(hù)易氧化的脂肪酸。UUU的含量在79%以上，而SUU的含量在14%左右。牡丹籽油甘油三酯中Sn-LOLn含量最高，為15.64%，其次為Sn-LnOLn，為14.77%。其中Sn-LLLn、Sn-LLnLn、Sn-LnLLn、Sn-LnLnLn的含量約為7%。其余甘油三酯相對較小，含量小于5%。

a-牡丹籽油甘油三酯總脂肪組成氣相色譜圖;b-牡丹籽油Sn-2位脂肪酸組成氣相色譜圖;1-肉豆蔻烷酸甲酯，2-十五烷酸甲酯，3-棕櫚酸甲酯，4-棕櫚油酸甲酯，5-十七烷酸甲酯，6-十七碳烯酸甲酯，7-硬脂酸甲酯，8-油酸甲酯，9-亞油酸甲酯，10-亞麻酸甲酯，11-花生酸甲酯，12-二十碳烯酸甲酯圖2 牡丹籽油甘三酯總脂肪組成及Sn-2位脂肪酸組成氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of total triglyceride composition and Sn-2 fatty acid composition of peony seed oil

表3 牡丹籽油立體專一分布相對百分含量

單位：%

表4 牡丹籽毛油甘油三酯結(jié)構(gòu)及組成分析Table 4 Analysis of structure and composition of glycerolthree fat in peony seed oil

注:UUU，三不飽和脂肪酸甘油三酯；SSU，一不飽和二飽和脂肪酸甘油三酯；SUU，一飽和二不飽和脂肪酸甘油三酯；SSS，三飽和脂肪酸甘油三酯。

2.4 牡丹籽油脂肪酸官能團(tuán)組成分析

圖3 牡丹籽油的拉曼光譜Fig.3 Raman spectroscopic map of peony seed oil

1 265 cm-1處的特征峰常被用來估計順式不飽和脂肪酸的總含量，如果樣品中存在反式雙鍵，則在這個波段沒有吸收峰[30]。由于在相同波長下，不同植物油拉曼光譜的光譜形態(tài)差異顯著，譜峰得到有效分離，可用于鑒別各類植物油；基于全波段光譜信息和形態(tài)建立的多步聚類分析模型還可準(zhǔn)確鑒定各種類型的摻偽植物油[31]。

表5 牡丹籽油拉曼光譜主要特征峰Table 5 Main characteristic peaks of Raman spectraof peony seed oil

3 結(jié)論

牡丹籽毛油脂肪酸組成有12種，主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其不飽和脂肪酸含量為(77.51±1.51) g/100 g。

由胰脂酶水解法測定牡丹籽油甘三酯Sn-2位脂肪酸分布表明：亞麻酸、棕櫚酸，硬脂酸主要分布在Sn-1、Sn-3位上；油酸主要分布在Sn-2位上，油酸以單甘油酯的形式在體內(nèi)被很好地吸收。亞油酸在Sn-1、Sn-2、Sn-3位上分布較平均。牡丹籽油甘油三酯中Sn-LOLn含量最高，為15.64%。

牡丹籽油的拉曼光譜表明，牡丹籽油有11個主要特征峰，其分子結(jié)構(gòu)顯著特征是含有酯基及碳碳雙鍵。值得注意的是，1 265 cm-1處的特征峰說明牡丹籽油幾乎不含反式脂肪酸。