畢思遠(yuǎn)，曹建濤，李保玲，朱志強(qiáng)*，曹濤，李森

1(哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150008) 2(濟(jì)南市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，山東 濟(jì)南，250000)3(廣東省檢迅檢測科技有限公司，廣東 東莞，523843) 4(深圳市匯知科技有限公司，廣東 深圳，518000)

有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides, OCPs)是一種公認(rèn)的持久性有機(jī)污染物[1]，對生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)均有毒性，可產(chǎn)生致畸、致癌效應(yīng)[2]。這類物質(zhì)可通過降雨、地表徑流等方式進(jìn)入水環(huán)境[3]，同時由于其具有高脂溶性，極易經(jīng)食物鏈在生物體內(nèi)富集并產(chǎn)生生物放大效應(yīng)[4]。有研究表明，食用魚類是人體農(nóng)藥攝入的重要途徑之一[5]，因?yàn)樗鼈兡芡ㄟ^皮膚和鰓直接從水環(huán)境中吸收OCPs，也能通過食物鏈放大作用富集OCPs[6]，其富集系數(shù)可達(dá)40 000倍[7]。因此，研究魚類中OCPs的殘留量對保障人體健康有重要意義。

魚肉樣品通常含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，基質(zhì)復(fù)雜，對其進(jìn)行分析時通常需要進(jìn)行富集和凈化等前處理操作。目前，我國關(guān)于水產(chǎn)品中有機(jī)氯農(nóng)藥測定主要采用GB 23200.88—2016，其中目標(biāo)物用丙酮-石油醚索氏提取，經(jīng)弗羅里硅土柱凈化后用氣相色譜測定，索氏提取需耗費(fèi)大量溶劑。凝膠滲透色譜[6,8]、硅膠固相萃取[4,9]和磺化[3]在魚肉樣品OCPs測定中運(yùn)用較多，但凝膠滲透色譜設(shè)備昂貴，溶劑耗費(fèi)較多，固相萃取凈化穩(wěn)定性好，回收率高，但操作效率低下，難以滿足大批量樣品快速檢測的要求，磺化能有效去除魚肉中的脂肪和蛋白質(zhì)，但大量硫酸易對操作人員造成身體傷害，且容易污染環(huán)境。QuEChERS方法操作簡便，回收率好，操作效率高，成功克服了上述樣品前處理方法的缺點(diǎn)[10]，已廣泛應(yīng)用于水果[11-12]、蔬菜[13-14]、糧食[15-16]和茶葉[17-18]等樣品中的農(nóng)藥殘留檢測，但在魚類等脂肪含量較高的動物樣品中OCPs檢測的應(yīng)用較少。

本試驗(yàn)在國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[10-19,20]的基礎(chǔ)上，建立超聲波輔助萃取，QuEChERS凈化，通過氣相色譜-氣質(zhì)聯(lián)用確證、氣相色譜定量測定魚肉中OCPs的檢測方法，并將其用于廈門海域10種魚類中OCPs的殘留分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B氣相色譜儀(配電子捕獲檢測器)、7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配EISS離子源)，美國Agilent公司； 3K15臺式高速離心機(jī)，德國SIGMA；N-EVAP 12管氮?dú)鉂饪s儀，上海安譜； T25組織勻漿機(jī)、Vortex GENIUS 3渦旋振蕩器，德國IKA。

丙酮、正己烷均為色譜純，美國Fisher Chemical；N-丙基乙二胺(PSA)、C18固相萃取吸附劑，美國Agilent公司；無水硫酸鎂、百靈威、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p’-DDE、o,p’-DDT、p,p’-DDD、p,p’-DDT艾氏劑、狄氏劑、七氯、環(huán)氧七氯、異狄氏劑、硫丹Ⅰ、硫丹Ⅱ，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

1.2 樣品的采集與制備

選取從某大型超市購買的青石斑魚作為方法驗(yàn)證樣品，在廈門海域近岸外的9.26 km漁船隨機(jī)購買10種常見魚類，采樣魚類相關(guān)參數(shù)見表1。海冰低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，每條取可食部分切成小塊，混合均勻后制成肉糜，-20 ℃冷凍保存，7 d內(nèi)完成分析。

表1 采樣魚類相關(guān)參數(shù)Table 1 Parameters for fishes

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

稱取魚肉樣品2.00 g于50 mL離心管，加10 mLV(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1，12 000 r/min勻漿提取1 min，加入0.4 g無水MgSO4和0.1 g無水醋酸鈉，劇烈振蕩1 min，超聲10 min，旋渦1 min，8 000 r/min離心2min，移取上清液6 mL于裝有400 mg PSA、150 mg C18和900 mg無水MgSO4的15 mL離心管，旋渦1 min，然后以8000 r/min離心2 min，取上清液5 mL于10 mL玻璃刻度試管，40 ℃氮?dú)鉂饪s近干，用0.1 mL正己烷溶解，旋渦后轉(zhuǎn)移至內(nèi)置襯管的進(jìn)樣小瓶，用GC-ECD定量，GC-MS確證。

1.3.2 儀器條件

1.3.2.1 氣相色譜條件

進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測器(ECD)溫度300 ℃，載氣N2流量1.2 mL/min，DB-1MS色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱初溫90 ℃,保持0.5 min，20 ℃/min升溫至180 ℃，10 ℃/min升溫至230 ℃，20 ℃/min升溫至280 ℃，保持6 min，進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測器(ECD)溫度300 ℃，載氣H2流量1.0 mL/min，DB-1MS色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱初溫50 ℃，保持0.5 min，20 ℃/min升溫至130 ℃，8 ℃/min升溫至250 ℃，15 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min，進(jìn)樣量2 μL。SIM采集模式，各組分采集離子參考GB 23200.8—2016。

1.4 方法性能測試

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為減小基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線系列。分別取各OCPs組分0.1 mL，用正己烷稀釋至10.00 mL，配成1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取陰性魚肉樣品按1.3.1處理定容后，用該正己烷溶液將1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

1.4.2 回收率、精密度、檢出限和定量限

取魚肉陰性樣品，添加1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.002、0.01和0.05 mL，使樣品中各OCPs的濃度為1.0、5.0和10 μg/kg，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，并計(jì)算各組分的精密度，每個濃度做6個平行試驗(yàn)。在最低添加濃度(1.0 μg/kg)的樣品結(jié)果中，以3倍信噪比計(jì)算魚肉樣品中各OCPs的檢出限，以10倍信噪比計(jì)算魚肉樣品中各OCPs的定量限。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評估

人體中所累積的有機(jī)污染物大部分來自食物，海產(chǎn)品作為沿海居民的主要食物來源，有必要評估OCPs對人體健康的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)采用世界衛(wèi)生組織規(guī)定的每日允許攝入量(acceptable daily intake,ADI)作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算居民每日膳食攝入量(estimated daily intake,EDI)，與GB 2763—2016中規(guī)定的ADI值相比較，評估OCPs對人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)[21]。具體計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：ω,魚肉中OCPs的濃度，μg/kg；CR,魚類人均每日攝入量，g/d；BW,消費(fèi)者體質(zhì)量，kg。

本試驗(yàn)中魚類人均每日攝入量CR按100 g/d計(jì)算，消費(fèi)者體質(zhì)量BW采用60 kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法性能試驗(yàn)

圖1 加標(biāo)樣品(0.5 μg/kg)中OCPs的分離色譜圖Fig.1 Gas chromatography of OCPs in fish samples addstandard 0.5 μg/kg

從圖1和表2可知，14種OCPs在1.3.2.1的儀器條件下，在1～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998 8。魚肉樣品含有15%～20%的蛋白質(zhì)和5%左右的脂肪，乙腈雖然廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜樣品的農(nóng)殘?zhí)崛。⒉贿m合脂肪含量偏高的樣品，因?yàn)橐译鏁沟鞍踪|(zhì)快速變形，阻礙乙腈滲透而導(dǎo)致萃取效率偏低。因此本研究采用GB23200.88—2016相似的萃取溶劑體系提取魚肉中的OCPs，采用V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1提取OCPs的同時會提取出魚肉中的脂質(zhì)，因此減少魚肉取樣量為2 g，同時采用先凈化后濃縮的方式，使PSA、C18和MgSO4與溶劑接觸更加充分，以獲得更好的凈化效果。結(jié)果表明，經(jīng)400 mg PSA、150 mg C18和900 mg無水MgSO4凈化后，可以基本消除脂質(zhì)對ECD的影響，同時使用GCMS對陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)，進(jìn)一步保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。用氣相色譜分析1.3.1處理后的加標(biāo)樣品，OCPs的回收率為86.5%～97.4%，精密度為4.8%～12.1%，最低檢出限為0.01 μg/kg，能夠滿足魚肉中的OCPs分析。

表2 有機(jī)氯農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、精密度、檢出限和定量限Table 2 The linear equations, correlation coefficients, recovery, precision, LOD and LOQ of OCPs

2.2 實(shí)際樣品有機(jī)氯農(nóng)藥分析及風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

OCPs具有疏水性，對脂質(zhì)具有很高的親和力，水環(huán)境中OCPs的生物富集效應(yīng)主要依靠水-脂的兩相分配[22]，魚類能夠直接從水中吸收OCPs，也能通過攝食富集OCPs，但是對OCPs的代謝緩慢，所以常被用于水環(huán)境的整體OCPs污染水平評價(jià)[23]。

2.2.1 六六六

HCHs曾經(jīng)作為一種廣譜農(nóng)藥而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，我國自1992年開始禁止使用六六六。工業(yè)的HCHs由4種異構(gòu)體組成，α-HCH(60%～70%)、β-HCH(5%～12%)、γ-HCH(10%～15%)、δ-HCH(6%～10%)，而林丹中的γ-HCH超過90%[24-25]。從表3可知，有3種魚類均檢出4種HCHs異構(gòu)體，這3種魚類均為肉食性中下層魚類。黃鯽和帶魚的HCHs含量最高，這可能是黃鯽為常棲息于淤泥底質(zhì)中，而帶魚脂肪含量較高的原因。所有異構(gòu)體中β-HCH的檢出率和平均濃度最高，α-HCH的檢出率最低。這可能是因?yàn)樵?種異構(gòu)體中，β-HCH最容易被底層淤泥富集[26]，且α-HCH和γ-HCH也可以轉(zhuǎn)化成β-HCH[27]；另外，由于β-HCH中氯原子的特殊位置，使其更難被降解[28]，導(dǎo)致β-HCH在沉積物中積累，然后在魚類等水生生物中富集。α-HCH/γ-HCH的值可以用來分析HCHs的來源，當(dāng)α-HCH/γ-HCH≥3時，表示水環(huán)境中的HCHs主要來自工業(yè)污染、大氣轉(zhuǎn)移和沉積物的輸入[29-30]，α-HCH /γ-HCH≤1時則表示污染來自于林丹[31-32]。從表3可以看出，10種魚類中4種HCHs異構(gòu)體殘留的濃度β-HCH>γ-HCH>δ-HCH>α-HCH，所有魚類中α-HCH與γ-HCH的比值均小于1，表明該水域中HCHs的污染來自于林丹。另外，本研究中的HCHs總量在ND～5.759 μg/kg，黃鯽和帶魚的EDI值最高，分別為5.759和5.665 μg/kg。

表3 魚類六六六農(nóng)藥含量

注：“ND”表示未檢測。下同。

2.2.2 滴滴涕

DDTs在采集魚類中的檢出率為100%，且濃度高于HCHs，可能是DDTs的疏水性更強(qiáng)，且生物富集系數(shù)更高的原因。龍頭魚、帶魚和鰳魚的DDTs含量最高，可能是因?yàn)辇堫^魚的脂肪含量高，DDTs更容易富集在脂肪組織，而帶魚和鰳魚則可能因?yàn)閭€體較大，生長年份較長，富集DDTs的時間更長所致。其平均濃度依次為DDD>DDE>DDT。DDT使用后，大部分DDT在有氧和厭氧條件下分別緩慢轉(zhuǎn)化為DDE和DDD[33-34]，因此，DDT和其代謝物(DDD+DDE)的比值常用來判斷DDT的使用時間和生物轉(zhuǎn)化的指標(biāo)[35]，也可以用于分析水環(huán)境中DDT的污染來源[29-30,36], DDT/(DDD+DDE)>1表示近期使用過DDT，反之則表示污染來自于早期使用的DDT[29-30,37]。從表4可以看出，所有魚類樣品中DDT/(DDD+DDE)均小于1，表明該水域中近期沒有受到新的DDT污染。另外，DDD與DDE的比值能反應(yīng)DDT的降解方式，DDD/DDE<1表示有氧降解，DDD/DDE>1表示無氧降解[38]。本研究中所有樣品中的DDD/DDE比值均為0.9～1.7，說明該水域魚類DDTs的降解途徑大部分是厭氧的。工業(yè)上O’P’-DDT與P’P’-DDT的比值在0.2～0.3，試驗(yàn)中O’P’-DDT /P’P’-DDT的比值為0.7～1.4之間，說明該水域最近可能有三氯殺螨醇輸入。各魚類DDTs的EDI值均遠(yuǎn)小于國標(biāo)規(guī)定的10 μg/kg BW，說明該水域魚類的DDTs殘留量是安全的，但是應(yīng)該警惕三氯殺螨醇輸入后引起的DDTs污染增加。

表4 魚類滴滴涕農(nóng)藥含量

2.2.3 硫丹、艾氏劑、狄氏劑和異狄氏劑

硫丹由硫丹Ⅰ和硫丹Ⅱ組成，這2種異構(gòu)體都對光降解具有很強(qiáng)的抵抗力，但是其代謝物硫丹硫酸鹽易受光分解的影響[39]。從表5可以看出，所有的魚肉中都檢出硫丹Ⅰ，只有82%的樣品檢出硫丹Ⅱ，但是抽樣魚類硫丹的平均含量：硫丹Ⅱ>硫丹Ⅰ，這可能是因?yàn)榱虻あ裨诔练e物中降解更快[40]。工業(yè)硫丹產(chǎn)品中硫丹Ⅰ和硫丹Ⅱ的比例約為2.33，可以用兩者的比值來判斷水域的硫丹污染時間，本研究同時檢出2種硫丹的魚類中硫丹Ⅰ/硫丹Ⅱ均小于1，說明該水域近幾年沒有受到新的硫丹污染[29-30]。

抽樣魚類中七氯和七氯環(huán)氧的檢出率分別為80%和90%，其濃度與魚肉中脂肪含量存在一定的相關(guān)性，脂肪含量較高的魚類中七氯含量較高，與王翀[2]的研究結(jié)果一致。從表5可知，七氯和環(huán)氧七氯檢出濃度都不高，這與湯清清等[41]的研究結(jié)果相比有所降低。

艾氏劑和狄氏劑均為環(huán)戊二烯結(jié)構(gòu)的殺蟲劑，被列入世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單。兩者在所有抽樣魚類中均未檢出，因?yàn)檫@類物質(zhì)在水中的溶解度低，且易于土壤緊密結(jié)合，在土壤和水中會緩慢向下遷移。此外，這些極性物質(zhì)對動物脂肪具有高度的親和力，容易導(dǎo)致其在食物鏈的富集。但是，此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，能在大氣中光降解。這可能會減少水環(huán)境中的污染程度[40]。

七氯(七氯和環(huán)氧七氯之和)和硫丹(硫丹Ⅰ與硫丹Ⅱ之和)的ADI分別為0.1 μg/kg BW和 6 μg/kg BW，均超過其EDI的100倍以上，說明食用這些魚類風(fēng)險(xiǎn)很小。

表5 魚類有機(jī)氯農(nóng)藥含量 單位：μg/kg

3 結(jié)論

魚肉樣品經(jīng)QuEChERS提取和凈化處理后，用氣相色譜檢測，質(zhì)譜確證，方法回收率為83.2%～103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.8%～12.1%，檢出限0.01～0.09 μg/kg，實(shí)際樣品分析結(jié)果表明：該法簡單、易操作，測定結(jié)果準(zhǔn)確，能滿足魚肉中多種OCPs的分析要求。采集的10種魚類均有OCPs檢出，含量在5.532～22.174 μg/kg之間，帶魚和鰳魚的OCPs含量最高，分別為22.174和19.910 μg/kg，P’P’-DDD、P’P’-DDE和β-HCH是最主要的OCPs污染物。各異構(gòu)體含量的比值表明廈門水域HCHs和DDTs大部分來自早期農(nóng)藥使用殘留，但有疑似排入三氯殺螨醇。整體OCPs較往年有所降低[2,41]，計(jì)算估計(jì)每日攝入量均遠(yuǎn)低于GB2763—2016規(guī)定的每日允許攝入量，食用該水域魚類產(chǎn)生有機(jī)氯農(nóng)藥危害的風(fēng)險(xiǎn)較低。