趙佳偉，敖曉琳*，蔡義民，劉書亮，陳安均，萬胡，徐飛，王帆，何金陽

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心，日本 茨城，305-8686；)3(四川李記樂寶食品有限公司，四川 眉山，620030)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用各種糖產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌不僅應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，而且對(duì)人體的健康有著不可忽視的影響。研究證實(shí)，乳酸菌可維持腸道健康，克服嬰兒腹瀉、抗生素相關(guān)性腹瀉，改善老年癡呆患者的認(rèn)知、情緒功能等[2-4]。因此乳酸菌功能及開發(fā)應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)。

生物膜(biofilm)這一專有名詞在1978年被提出，也有其他學(xué)者翻譯為生物被膜[5],指菌體被胞外聚合物(EPS)包裹附著在載體表面的混合物[6]。HIROMI等[7]研究了形成生物膜之后的植物乳桿菌JCM 1149和浮游菌株在各種有機(jī)酸、乙醇和次氯酸鈉中的生長(zhǎng)情況，研究結(jié)果表明,生物膜中的微生物比浮游菌株表現(xiàn)出更好的抗逆性。KIEW等[8]研究發(fā)現(xiàn)，成膜后的鼠李糖乳桿菌比浮游菌株具有更好的耐熱性，并且可以在模擬胃腸道的環(huán)境中維持更高的活性。

生物膜的形成受到很多因素影響，包括載體表面的粗糙程度、pH、黏附力、基因調(diào)控和金屬離子等[9-11]。其中金屬離子對(duì)于生物膜的形成具有明顯的作用。一定濃度的Mg2+可以刺激初期生物膜的產(chǎn)生；Fe3+主要是促進(jìn)胞外蛋白的分泌，產(chǎn)生架橋作用，提高基因的表達(dá)水平來提高生物膜的穩(wěn)定性；低濃度的Na+通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)和補(bǔ)償生物膜表型不穩(wěn)定來促進(jìn)生物膜的形成[12]。本試驗(yàn)旨在篩選出對(duì)植物乳桿菌RS66CD生物膜形成具有明顯促進(jìn)作用的金屬離子，來提高其環(huán)境抗逆性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)RS66CD，從優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)泡菜中篩選得到，具有良好的發(fā)酵性能。

MRS液體培養(yǎng)基，凱恒生物科技有限公司；改良MRS液體培養(yǎng)基(去掉MRS液體培養(yǎng)基中的MgSO4·7H2O和MnSO4·4H2O)；NaCl、CaCl2、MgCl2、FeCl3、MnCl2、戊二醛、結(jié)晶紫(均為國(guó)產(chǎn)分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，力辰科技；PHS-4C+精密pH計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；3001酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；SORVALL高速離心機(jī)，美國(guó)科駿儀表有限公司；EVO18掃描電鏡，Carl Zeiss。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌成膜菌株和游離菌株的制備

試驗(yàn)組(成膜菌株)：將活化好的植物乳桿菌按照1%的接種量，接入改良MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中金屬離子的種類、含量和培養(yǎng)條件根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定。觀察金屬離子和不同培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響。

對(duì)照組(游離菌株)：活化好的植物乳桿菌按1%的比例，接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

空白對(duì)照組(未加金屬離子)：活化好的植物乳桿菌按1%的比例，接入改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 生物膜半定量測(cè)試

活化好的菌株按照1%比例接種(其中試驗(yàn)組接種到改良MRS液體培養(yǎng)基，對(duì)照組接種到MRS液體培養(yǎng)基中)，添加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔添加200 μL，在不同條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后倒出培養(yǎng)液，用無菌水沖洗3次，56 ℃干燥固定1 h。加入0.5%結(jié)晶紫50 μL，染色5～10 min，用無菌蒸餾水清洗2～3次，37 ℃晾干，測(cè)定OD490 nm[13]。采用OD490 nm來反映生物膜的形成量：A490≤0.17表明沒有形成；A490>0.34表明大量生成[14]。

1.3.3 生物膜形態(tài)觀察

將消毒過后的蓋玻片置于24孔板中，按照1∶100的比例將菌體與改良的MRS液體培養(yǎng)基混合均勻，每孔添加1 mL，按后續(xù)設(shè)計(jì)的金屬離子濃度及培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。取出蓋玻片置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中，4 ℃固定8 h，再依次用40%、70%、90%和100%(2次)的乙醇脫除水分，每次15 min，再進(jìn)行干燥、鍍金及掃描電鏡觀察[15]。以MRS液體培養(yǎng)基在37 ℃下，培養(yǎng)24 h作為對(duì)照組。

1.3.4 金屬離子對(duì)植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響

分別向改良MRS液體培養(yǎng)基中添加NaCl(40、44、46、48、52、56、60 g/L)、CaCl2(5、15、25、35、45、55 g/L)、MgCl2(5、15、25、35、45、55 g/L)、MnCl2(5、15、25、35、45，55 g/L)、FeCl3(15、25、35、45、55 g/L)，考察乳酸菌在不同金屬離子及不同濃度對(duì)生物膜形成的影響。將過夜活化培養(yǎng)后的植物乳桿菌按1%的比例分別接種至上述的培養(yǎng)基中，振蕩搖勻后加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔添加200 μL，37 ℃放置24 h[16]。按照1.3.2的方法對(duì)生物膜形成量進(jìn)行測(cè)定。按照1.3.3的方法進(jìn)行掃描電鏡觀察，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌生物膜RS66CD形成的影響

1.3.5.1 培養(yǎng)溫度

在確認(rèn)最佳金屬離子及作用范圍下，參照任曉鏷[17]的方案，將植物乳桿菌按照1%的比例接種，分別在8、15、20、25、37、42、50 ℃下培養(yǎng)24 h，按照1.3.2的方法測(cè)定形成量。

1.3.5.2 培養(yǎng)時(shí)間

在確認(rèn)的最佳金屬離子及添加量下，將植物乳桿菌按照1%的比例接種，37 ℃分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h[18]。按照1.3.2的方法測(cè)定形成量。

1.3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取金屬離子添加量、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以植物乳桿菌實(shí)際成膜量為標(biāo)準(zhǔn)，未接種的MRS液體培養(yǎng)基作為空白組，如公式(1)所示。

實(shí)際成膜量=OD值試驗(yàn)組-OD值空白組

(1)

1.3.7 植物乳桿菌RS66CD生物膜耐受性測(cè)定

1.3.7.1 溫度耐受性

參照司淼菲[19]的方法，將1.3.6最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的試驗(yàn)組和MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h的對(duì)照組,分別接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，菌液濃度均為106CFU/mL。置于55、60、65、70 ℃下水浴30 min，平板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活率，來比較成膜前后的菌株對(duì)溫度的耐受性。

1.3.7.2 鹽耐受性

將1.3.6最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的試驗(yàn)組和MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h的對(duì)照組,分別接種至5 mL的NaCl含量為60、80、100、120、140 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中[16]，菌液濃度均為106CFU/mL，37 ℃處理4 h，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。分別計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活率，比較成膜前后的菌株對(duì)不同鹽濃度的耐受性。

1.3.7.3 pH耐受性

將1.3.6最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的試驗(yàn)組和MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h的對(duì)照組,分別接種到5 mL的pH值為2、3、4、8、9的MRS液體培養(yǎng)基中，菌液濃度均為106CFU/mL，37 ℃處理4 h，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。分別計(jì)算兩者的存活率，來比較對(duì)不同pH的耐受性。

1.3.7.4 膽鹽耐受性

配制膽鹽質(zhì)量濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L的5 mL的MRS液體培養(yǎng)基，將1.3.6最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的試驗(yàn)組和MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h的對(duì)照組分別接種到培養(yǎng)基中，菌液濃度均為106CFU/mL，37 ℃處理4 h，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。分別計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活率，來比較成膜前后的菌株對(duì)不同膽鹽濃度的耐受性。

1.3.7.5 存活率計(jì)算

分別計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組經(jīng)不同條件處理后的存活率,對(duì)比兩者耐受性。按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品做3個(gè)平行，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。最終數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行Duncan多重比較和方差分析，顯著性水平為0.05，不同字母表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響

2.1.1 不同金屬離子對(duì)生物膜形成的影響

由圖1可知，添加NaCl，CaCl2，MgCl2和MnCl2所測(cè)定的OD值均大于0.34，而FeCl3所有濃度下測(cè)定的OD值均小于0.17。說明Fe3+促進(jìn)植物乳桿菌生物膜形成的能力較小，而Na+、Ca2+、Mg2+和Mn2+都具有不同程度促進(jìn)生物膜形成的能力，其中Na+的促進(jìn)效果最為明顯。但從圖1也可以看出，對(duì)照組所測(cè)OD值大于一些添加低濃度的金屬離子。這主要是由于植物乳桿菌RS66CD本身產(chǎn)胞外多糖，并且對(duì)照組的培養(yǎng)基更適合微生物的生長(zhǎng)，所以會(huì)導(dǎo)致更多的菌體附著在96孔板底部。選取Na+，Mg2+，Ca2+，Mn2+和Fe3+所測(cè)OD值最大的濃度以及游離菌株進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果如圖2所示，Na+的促進(jìn)效果最為明顯，故確定48 g/L的Na+作為后續(xù)試驗(yàn)添加的金屬離子。

圖1 不同金屬離子對(duì)于植物乳桿菌生物膜形成的影響Fig.1 L. plantarum biofilm effected by different metal ions注：不同字母代表差異顯著，P<0.05。下同。

a-Mn2+添加量為35 g/L;b-Ca2+添加量為25 g/L;c- Mg2+添加量為25 g/L;d- Fe3+添加量為35 g/L;e-Na+添加量為48 g/L;f-游離菌株圖2 不同金屬離子最適濃度下生物膜的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of biofilm at optimum concentrations ofdifferent metal ions

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物膜形成的影響

生物膜的形成具有幾個(gè)明顯的生理階段，包括表面黏附、微菌落形成、生物膜的成熟和生物膜分散[20]。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物乳桿菌生物膜形成的影響如圖3所示，由于12 h的培養(yǎng)時(shí)間較短，菌體還處于生長(zhǎng)階段，產(chǎn)膜量較小，所以附著在96孔板底部的菌體量少，因此OD值也較小。培養(yǎng)至24 h時(shí)，開始形成生物膜來抵御鹽脅迫的不良環(huán)境，36 h處生物膜達(dá)到最大量，此時(shí)OD值也最大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，生物膜開始逐漸發(fā)生解聚，OD值下降。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物乳桿菌生物膜形成的影響Fig.3 L. plantarum biofilm effected by culture time

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)生物膜形成的影響

從圖4可知，不同溫度條件下培養(yǎng)對(duì)菌株RS66CD生物膜形成的影響差異性顯著。由試驗(yàn)結(jié)果來看，在15和37 ℃時(shí)出現(xiàn)2個(gè)高峰。37 ℃為乳酸菌最適生長(zhǎng)溫度，因此在37 ℃條件下培養(yǎng)有助于菌體生長(zhǎng)，累積的生物膜形成量也最大。15 ℃作為適宜的低溫脅迫，菌體在此溫度脅迫下，產(chǎn)生生物膜來抵抗不良環(huán)境[13]。而培養(yǎng)溫度過低或過高都會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體密度過低，不能形成穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)植物乳桿菌生物膜形成的影響Fig.4 L. plantarum biofilm effected by culturetemperature

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了L9(3)4正交試驗(yàn)。以實(shí)際成膜量作為評(píng)判依據(jù)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選出最優(yōu)組合。結(jié)果如表2所示，對(duì)植物乳桿菌生物膜形成最主要的影響因素為時(shí)間，其次為Na+濃度及培養(yǎng)溫度(B>A>C)。得出最佳培養(yǎng)條件為A3B1C3，即NaCl添加量53 g/L， 40 ℃下培養(yǎng)24 h。將每個(gè)單因素最佳濃度，正交試驗(yàn)得出的最佳培養(yǎng)條件和游離菌株通過掃描電鏡進(jìn)行觀察，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，在正交試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)的植物乳桿菌形成的生物膜最明顯。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

a-最適培養(yǎng)溫度;b-最適培養(yǎng)時(shí)間;c-最適鈉離子添加量d-正交試驗(yàn)最適條件;e-游離菌株圖5 不同培養(yǎng)條件下生物膜形成以及游離菌株掃描電鏡圖Fig.5 SEM to observe biofilms of different culture conditionsand free strains

2.3 植物乳桿菌RS66CD在生物膜形成前后對(duì)環(huán)境耐受性的影響

2.3.1 溫度耐受性

結(jié)果如圖6所示，隨著溫度的升高，兩者的存活率呈下降趨勢(shì)，但是由于試驗(yàn)組的菌體形成了生物膜，在相同處理溫度下比對(duì)照組表現(xiàn)出更好的抗逆性。由圖6可以看出來，試驗(yàn)組在70 ℃處理30 min后還具有一定的活性，說明生物膜的形成可以更好地保護(hù)菌體，同時(shí)也可能由于試驗(yàn)組在培養(yǎng)時(shí)溫度較高，提高了菌體的熱應(yīng)激能力。但在65 ℃以后，試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活率都大幅度降低，說明生物膜提高菌體對(duì)溫度耐受性是有一定范圍的。在工業(yè)生產(chǎn)上可以利用這一特點(diǎn)，來保證殺滅雜菌的同時(shí)維持乳酸菌的活性[21]。

圖6 成膜菌株與游離菌株對(duì)溫度的耐受性Fig.6 The tolerance to temperature of biofilm and planktonicL. plantarum

2.3.2 鹽濃度耐受性

結(jié)果如圖7所示，隨著鹽濃度的不斷增加，兩者的存活率均在降低。但是在相同鹽濃度條件下，試驗(yàn)組表現(xiàn)出更好的鹽耐受性。同時(shí)隨著鹽濃度的增加，試驗(yàn)組存活率的比例也在不斷的上升。說明生物膜的形成提高了對(duì)鹽度的耐受性。

圖7 成膜菌株與游離菌株對(duì)鹽的耐受性Fig.7 The tolerance to NaCl of biofilm and planktonicL. plantarum

2.3.3 pH耐受性

pH值對(duì)于微生物的生理活性具有至關(guān)重要的影響，可以通過改變酶活性來影響微生物的生理代謝，或者通過改變微生物表面電荷來影響物質(zhì)的吸收[22]。從圖8可以看出，供試pH條件下，試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活率都在下降，將pH調(diào)整到2時(shí)，菌體完全失活；試驗(yàn)組比對(duì)照組表現(xiàn)出更好的耐受性。這可能是由于EPS的官能團(tuán)隨著pH增加而增加，絮凝效果增強(qiáng)，但是超出這一范圍則會(huì)呈現(xiàn)相反的效果[23-24]。

圖8 成膜菌株與游離菌株對(duì)pH的耐受性Fig.8 The tolerance to pH of biofilm and planktonicL. plantarum

2.3.4 膽鹽耐受性

從圖9可以看出，在膽鹽質(zhì)量濃度低于0.50 g/L時(shí)，試驗(yàn)組的存活率明顯高于對(duì)照組，表現(xiàn)出對(duì)膽鹽良好的耐受性。植物乳桿菌要進(jìn)入人體發(fā)揮作用，必定要經(jīng)過胃酸，膽鹽等消化液的消化。所以可以通過使植物乳桿菌形成生物膜，來提高進(jìn)入人體后的存活率。隨著膽鹽濃度的增加，菌體的存活率也明顯下降，但試驗(yàn)組存活率明顯高于對(duì)照組。說明生物膜的形成可以保護(hù)菌體，使其在一定膽鹽濃度下存活。

圖9 成膜菌株與游離菌株對(duì)膽鹽耐受性Fig.9 The tolerance to bile salt of biofilm and planktonicL. plantarum

3 討論

本試驗(yàn)主要研究了幾種金屬離子對(duì)于植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響，首先確定影響效果最顯著的金屬離子，在此基礎(chǔ)上選取最佳金屬離子的添加量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度3個(gè)單因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最適培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，NaCl添加量為53 g/L，40 ℃培養(yǎng)24 h，植物乳桿菌形成的生物膜最顯著。

研究結(jié)果與徐文生[25]、謝麗斯等[26]的研究結(jié)果相似，即在低濃度條件下Na+可以促進(jìn)生物膜形成，但隨著Na+濃度不斷升高生物膜的形成會(huì)逐漸受到抑制。這可能是由于在一定滲透壓下，菌體會(huì)產(chǎn)生生物膜來抵抗不良環(huán)境。同時(shí)在鹽脅迫條件下，會(huì)導(dǎo)致raf、GroEL、DanK、LuxS等基因的表達(dá)，從而調(diào)控生物膜的形成[16,27]。并且滲透壓可以補(bǔ)償生物膜表型不穩(wěn)定，使生物膜變得平滑[28]。

通過比較試驗(yàn)組和對(duì)照組處理后的存活率，得出成膜后植物乳桿菌的耐受性顯著增加。其中在溫度耐受性試驗(yàn)中試驗(yàn)組的存活率比對(duì)照組平均高出5倍；pH值耐受性中高出2.8倍；鹽耐受性中高出5倍；膽鹽耐受性中高出7倍。此外AKINBOBOLA[29]及黃忠強(qiáng)[30]等的研究分別表明，形成生物膜后綠膿桿菌對(duì)鹽濃度耐受性和金黃色葡萄球菌對(duì)消毒劑耐受性顯著提升。這可能是由于生物膜的形成可以減緩氧化應(yīng)激對(duì)菌體的傷害，生物膜基質(zhì)和相關(guān)多糖可以提高菌體對(duì)極端環(huán)境的耐受性[31]。綜上所述，生物膜作為一種生物屏障，使存在其中的菌體相較于單個(gè)游離菌株在面對(duì)不良環(huán)境時(shí)顯示出更好的抗逆性。

在工業(yè)生產(chǎn)中，可以通過添加適當(dāng)?shù)腘a+來促使生物膜的形成，從而提高植物乳桿菌對(duì)環(huán)境的抗逆性。本試驗(yàn)探究了植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的最適條件，對(duì)比了形成生物膜前后的環(huán)境耐受性。但是對(duì)調(diào)控生物膜形成的相關(guān)基因還未進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)希望為以后利用生物膜提高植物乳桿菌環(huán)境耐受性提供新的思路和方法。