孫思佳，翟磊，白秀彬，許玲，于盼盼，姚粟*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，北京，100015)2(山東扳倒井股份有限公司，山東 淄博，256300)

淀粉酶是一類(lèi)重要的糖苷水解酶，可作用于淀粉，將其分解為糊精、麥芽糖、葡萄糖等小分子糖，根據(jù)作用方式的不同，分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶等[1]。作為工業(yè)應(yīng)用中最廣泛的一類(lèi)酶，淀粉酶在發(fā)酵、食品、飼料、醫(yī)療和印染等領(lǐng)域都具有重要應(yīng)用價(jià)值[2]，如添加適量中溫α-淀粉酶到面粉中，可以有效改善面團(tuán)質(zhì)量，增強(qiáng)面條口感與質(zhì)構(gòu)咀嚼性[3]；在啤酒釀造時(shí)添加淀粉酶高粱輔料，可降低啤酒生產(chǎn)成本，增加企業(yè)效益[4]；在禽畜飼料中添加淀粉酶可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)禽畜生產(chǎn)性能[5-6]。

白酒釀造離不開(kāi)大曲，而淀粉酶則是大曲中重要的一類(lèi)水解酶[7]，對(duì)于大曲原料利用以及白酒風(fēng)味物質(zhì)形成具有重要作用[8]，還穩(wěn)定出酒率，提高基酒質(zhì)量[9]。大曲中淀粉酶主要來(lái)源于大曲微生物，但目前對(duì)大曲中產(chǎn)淀粉酶菌株的研究多集中于細(xì)菌及霉菌[10-15]，對(duì)高產(chǎn)淀粉酶酵母研究的較少。

扣囊復(fù)膜孢酵母是一類(lèi)產(chǎn)子囊孢子的二形態(tài)酵母[16]，廣泛存在于高淀粉含量基質(zhì)中，能夠分泌淀粉酶、酸性蛋白酶及β-葡萄糖苷酶[17-19]，是大曲發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)菌種，在白酒釀造過(guò)程中被廣泛分離使用[20-22]。作為產(chǎn)生淀粉分解酶類(lèi)最好的子囊孢子菌之一，扣囊復(fù)膜孢酵母在釀酒行業(yè)極具應(yīng)用潛力，因此對(duì)篩選得到的高產(chǎn)淀粉酶扣囊復(fù)膜孢酵母進(jìn)行研究是十分必要的。

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析對(duì)篩選自芝麻香型白酒高溫大曲中的高產(chǎn)淀粉酶菌株扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)CICC 33077進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，并對(duì)該酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步探究，旨在為該菌株在制曲及白酒生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

S.fibuligeraCICC 33077分離于扳倒井芝麻香型白酒高溫大曲，保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)。

1.2 試驗(yàn)試劑

麥芽浸粉瓊脂(malt extract agar，MEA) 培養(yǎng)基、麥芽浸粉肉湯(malt extract broth，MEB) 培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限公司。

可溶性淀粉,天津市福晨化學(xué)試劑廠；無(wú)水葡萄糖,廣東汕頭市西隴化工廠；K2HPO4、KH2PO4,北京化工廠；麥芽浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

FE20型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；HH3A型恒溫水浴鍋,國(guó)華電器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基及主要試劑配制

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：麥芽浸粉3.586%、大豆蛋白胨1.216%、蛋白胨1.470%、K2HPO41.148%，pH 6.0，121 ℃下滅菌15 min。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖0.1 g，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

質(zhì)量濃度10 g/L可溶性淀粉緩沖液：準(zhǔn)確稱(chēng)取可溶性淀粉1.0 g，加入少量蒸餾水煮沸至透明，冷卻后加入0.2 mol/L pH 5.50磷酸緩沖液10 mL，定容至100 mL。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)試劑：準(zhǔn)確稱(chēng)取DNS 6.3 g、NaOH 21 g，加水，加熱至50 ℃全溶，稱(chēng)取酒石酸鉀鈉182 g于300 mL水中，加熱溶解并倒入前溶液中，加入重蒸苯酚5 g、無(wú)水Na2SO45 g，溶解后定容至1 000 mL，過(guò)濾,貯于棕色瓶中放置7 d后使用。

1.4.2 種子液制備

菌株活化：將甘油保藏的S.fibuligeraCICC 33077接種到MEA斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取一環(huán)接種到MEB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。

種子液制備：按照2%接種量將活化后的S.fibuligeraCICC 33077接種于裝液量為50 mL/250 mL種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.4.3 粗酶液制備

取1 g固體發(fā)酵物，加水定容至200 mL，靜置浸提30 min后，于5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液為粗酶液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)糖液組，在裝有0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)糖液的試管中加入1.5 mL DNS試劑，于沸水中煮沸15 min，冷卻，加入10.5 mL蒸餾水，搖勻后在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值A(chǔ)。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

1.4.5 淀粉酶酶活力的測(cè)定方法

使用DNS[23]法測(cè)定淀粉酶活力：將1 mL粗酶液加入到9 mL pH 5.5的質(zhì)量濃度10 g/L淀粉緩沖液中，50 ℃恒溫水浴中精確反應(yīng)20 min后迅速吸取0.5 mL反應(yīng)液加入到1.5 mL DNS試劑中，終止反應(yīng)，后續(xù)處理參照1.4.4。利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的還原糖(以葡萄糖計(jì))量。淀粉酶活力單位定義為：1 mL粗酶液(或1g固體發(fā)酵物)在pH 5.0、50 ℃的條件下，1 h水解質(zhì)量濃度10 g/L淀粉液生成1 μmol葡萄糖為1個(gè)酶活力單位，以μ/mL(μ/g)表示。

1.4.6 產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基原料確定

分別選取麩皮、高粱、玉米、小麥和稻谷5種原料(除麩皮外，均帶皮粉碎)25 g裝入500 mL三角瓶中，按照干基量的40%加入10 mL水，滅菌后接入10% 種子液，30 ℃培養(yǎng)96 h后，檢測(cè)發(fā)酵物淀粉酶活力，選取酶活最高者為后續(xù)試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的原料。

(2)單因素試驗(yàn)

確定發(fā)酵培養(yǎng)基原料后，分別探究原料添加量、干基含水量、接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間對(duì)S.fibuligeraCICC 33077固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，確定不同因素的適宜范圍及后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

(3)Box-Behenken響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 10.0.4軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理[24-25]，以淀粉酶酶活力為響應(yīng)值，選取對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大的原料添加量、干基含水量、發(fā)酵溫度和接種量4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵的最佳條件組合。每個(gè)試驗(yàn)組合做3組平行，取平均值，其中各影響因素水平編碼如表1所示。

從坐標(biāo)系oxyz所觀察的車(chē)輪上的一點(diǎn)，其位置既可以用直角坐標(biāo)(x，y，z)來(lái)描述，也可以用柱坐標(biāo)(r，y，θ)來(lái)確定，此處環(huán)向角θ定義了一個(gè)過(guò)輪軸線的截面，稱(chēng)為θ面。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnkenexperiments design

1.4.7 淀粉酶性質(zhì)初探

(1)酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定

在優(yōu)化得到的產(chǎn)淀粉酶最佳條件組合下發(fā)酵72 h，以pH 5.5的質(zhì)量濃度10 g/L的可溶性淀粉緩沖液為底物，按照上述酶活力的測(cè)定方法，分別在30、40、50、60、70 ℃條件下測(cè)定發(fā)酵物淀粉酶活力，并以淀粉酶酶活力最高者為100%。

(2)酶最適反應(yīng)pH值測(cè)定

在優(yōu)化得到的產(chǎn)淀粉酶最佳條件組合下發(fā)酵72 h，分別用pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液配制質(zhì)量濃度10 g/L的可溶性淀粉為底物，按照上述酶活力的測(cè)定方法，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定發(fā)酵物的淀粉酶活力，并以淀粉酶酶活力最高者為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基原料確定

淀粉酶是一類(lèi)水解酶，不同的原料對(duì)S.fibuligeraCICC 33077發(fā)酵產(chǎn)酶均有影響。試驗(yàn)選取麩皮、高粱、玉米、小麥、稻谷為原料進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，結(jié)果表明(圖1)，發(fā)酵培養(yǎng)基以麩皮為原料時(shí)，酶活力最高，達(dá)到7 000 U/g以上；以高粱、小麥為原料時(shí)，酶活力相當(dāng)，為2 500 U/g左右，而以玉米和稻谷為原料時(shí)，淀粉酶活力相對(duì)較低。麩皮價(jià)格低廉，且所產(chǎn)淀粉酶活力最高，因此選取麩皮為后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基原料。

圖1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基原料發(fā)酵試驗(yàn)Fig.1 Fermentation test of different fermentationmedium raw materials

2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.2.1 原料添加量對(duì)S.fibuligeraCICC 33077 產(chǎn)酶的影響

圖2 原料添加量單因素試驗(yàn)Fig.2 Single factor test of raw material amount

2.2.2 含水量對(duì)S.fibuligeraCICC 33077 產(chǎn)酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，分別按干基質(zhì)量的20%、40%、60%、80%、100%、120% 加入一定量的水，接入10% 種子液，30 ℃發(fā)酵96 h后，測(cè)定淀粉酶活力，探究干基含水量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原料水含量在 20%～40%內(nèi)，隨水含量增加，淀粉酶活力增大，當(dāng)水含量為40%時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，當(dāng)水含量超過(guò)40%時(shí)，淀粉酶活力有下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槲⑸锏囊磺写x活動(dòng)都離不開(kāi)水，水分含量的高低直接影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率；當(dāng)培養(yǎng)基干基含水量為40% 時(shí)，麩皮濕潤(rùn)疏松，培養(yǎng)基的顆粒之間存在合適的空隙，利于O2融入、CO2排出和菌體生長(zhǎng)繁殖，從而增加產(chǎn)酶量[27]；當(dāng)含水量過(guò)低時(shí)，不能維持菌體生長(zhǎng)特性，引起細(xì)胞新陳代謝不平衡，影響產(chǎn)酶量；而當(dāng)含水量過(guò)高時(shí)，物料易結(jié)塊成團(tuán)，多孔性降低，物料內(nèi)的氣體交換減少，培養(yǎng)基透氣性下降，難以進(jìn)行通風(fēng)和散熱，不利于微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此，40%水含量為培養(yǎng)基最適含水量，并以此作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。

圖3 含水量單因素試驗(yàn)Fig.3 Single factor test of water content

2.2.3 接種量對(duì)S.fibuligeraCICC 33077 產(chǎn)酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，按干基質(zhì)量的40% 加入一定量的水，分別接入10%、20%、30%、40%、50%的種子液，30℃發(fā)酵96 h后，測(cè)定淀粉酶活力，探究接種量對(duì)于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著接種量增加，酶活也相應(yīng)增大，當(dāng)種子液接種量為20%時(shí)，淀粉酶活力達(dá)到最大，當(dāng)接種量大于20%時(shí)，淀粉酶活力反而減小。這是因?yàn)榻臃N量過(guò)小時(shí)，會(huì)造成菌體細(xì)胞生長(zhǎng)量小，菌株到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延滯，從而延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，對(duì)產(chǎn)酶有不利影響；而接種量過(guò)大，菌體生長(zhǎng)過(guò)旺，會(huì)加快培養(yǎng)基消耗，菌體快速進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，同時(shí)大量產(chǎn)熱，造成培養(yǎng)基內(nèi)部溫度快速升高，對(duì)產(chǎn)酶有不利影響[28]。因此選取接種量20%為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。

圖4 接種量單因素實(shí)驗(yàn)Fig.4 Single factor test of inoculum dosage

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)S.fibuligeraCICC 33077 產(chǎn)酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，按加入原料質(zhì)量的40% 加入一定量的水，接入10%種子液，分別于20、25、30、37、42 ℃發(fā)酵96 h后，測(cè)定淀粉酶活力，探究發(fā)酵溫度對(duì)于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，25 ℃條件下菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，淀粉酶活力達(dá)到11 716 U/g，而溫度過(guò)低或過(guò)高條件下均不利于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶。這是因?yàn)闇囟炔粌H影響微生物的生長(zhǎng)速率、細(xì)胞組成以及營(yíng)養(yǎng)需求，同時(shí)還影響離子的運(yùn)輸和擴(kuò)散、細(xì)胞膜的滲透壓及表面張力[29]；在一定范圍內(nèi)，微生物生長(zhǎng)速率隨溫度升高而增加，同時(shí)產(chǎn)酶也增加；但溫度過(guò)高時(shí)，菌體雖生長(zhǎng)旺盛，但培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被過(guò)多用于菌體自身生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酶速率會(huì)相對(duì)降低，且酶活性喪失較快[30]。因此對(duì)菌株CICC 33077而言，最適產(chǎn)酶發(fā)酵溫度為25 ℃，并以此作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。

圖5 發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)Fig.5 Single factor test of fermentation temperature

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)S.fibuligeraCICC 33077 產(chǎn)酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，按干基量的40% 加入一定量的水，接入10%種子液，于30 ℃分別發(fā)酵24、48、72、96、120 h后，測(cè)定淀粉酶活力，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。在24～72 h內(nèi)，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)酶不斷增加，72 h后產(chǎn)酶趨于平緩且在96 h后有下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵?2 h前，基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尚未耗盡，隨著微生物不斷繁殖，產(chǎn)酶逐漸增加，之后基質(zhì)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，微生物開(kāi)始死亡，產(chǎn)酶趨于平緩，同時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，所產(chǎn)淀粉酶開(kāi)始失活，因此有下降趨勢(shì)?？紤]到在72～96 h范圍內(nèi)淀粉酶活力變化不大，為節(jié)省時(shí)間成本，將72 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)發(fā)酵時(shí)間不作為后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素。

圖6 發(fā)酵時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)Fig.6 Single factor test of fermentation time

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

利用實(shí)驗(yàn)軟件Design Expert進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果以淀粉酶活力(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合分析，得到淀粉酶活力(Y)對(duì)原料添加量(A)、含水量(B)、發(fā)酵溫度(C)、接種量(D)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=11 688.07-1 272.38A+1 953.48B-1 228.66C+390.20D-1 986.14AB-343.76AC-1 200.70AD-1 620.62BC-2 762.61BD-810.37CD-3 706.54A2-3 109.39B2-4 033.15C2-1 507.16D2。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果顯示，模型P值為0.000 2<0.01(表3)，說(shuō)明擬合回歸方程有意義，模型達(dá)到極顯著水平；且失擬項(xiàng)P=0.210 3>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較小，實(shí)驗(yàn)精度高，能夠較好描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果且用于預(yù)測(cè)考察因素與淀粉酶活力之間的關(guān)系。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注： “*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

根據(jù)方差分析結(jié)果及各因素間響應(yīng)面立體分析圖，原料添加量(A)、發(fā)酵溫度(C)對(duì)菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶影響顯著，含水量(B)影響極顯著；同時(shí)，原料添加量與含水量交互作用(圖7)、含水量與發(fā)酵溫度交互作用影響顯著(圖8)；含水量與接種量交互作用影響極顯著(圖9)，當(dāng)含水量一定時(shí)，淀粉酶的酶活力隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。

圖7 原料添加量和含水量交互作用對(duì)淀粉酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour polt showing theeffects of raw material amount and water content onamylase activity

圖8 含水量和溫度交互作用對(duì)淀粉酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour polt showing the effectsof water content and temperature on amylase activity

圖9 含水量和接種量交互作用對(duì)淀粉酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour polt showing theeffects of water content and inoculum dosage onamylase activity

根據(jù)軟件分析計(jì)算結(jié)果，淀粉酶活力預(yù)測(cè)最大值是12 506.69 U/g，最優(yōu)條件為原料添加量20 g，含水量51%，發(fā)酵溫度24 ℃，接種量18%。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)酵物淀粉酶活力實(shí)際值為(12 297±302) U/g，與預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明該模型可用于該菌株產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。

2.4 淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定

淀粉酶最適反應(yīng)溫度試驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，S.fibuligeraCICC 33077所產(chǎn)淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，淀粉酶在30～50 ℃條件下能夠保持60%以上的酶活力，超過(guò)60 ℃時(shí)，酶活喪失較大。這說(shuō)明該菌株所產(chǎn)淀粉酶能夠適應(yīng)大曲發(fā)酵環(huán)境，在大曲發(fā)酵前中期充分發(fā)揮作用，水解大曲原料。

圖10 反應(yīng)溫度對(duì)S.fibuligera CICC 33077淀粉酶活力的影響Fig.10 Effect of reaction temperature on amylase activityof S. fibuligera CICC 33077

2.4.2 酶最適反應(yīng)pH值測(cè)定

淀粉酶最適反應(yīng)pH值試驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，S.fibuligeraCICC 33077所產(chǎn)淀粉酶的最適反應(yīng)pH值為4.0，在pH 3.0～6.0條件下能夠保持70%以上的淀粉酶活力。這說(shuō)明該菌株所產(chǎn)淀粉酶在較酸的環(huán)境中具有較好的反應(yīng)活性，能夠適應(yīng)大曲發(fā)酵酸性環(huán)境，并在大曲發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖11 反應(yīng)pH值對(duì)S.fibuligera CICC 33077淀粉酶活力的影響Fig.11 Effect of reaction pH value on amylase activityof S. fibuligera CICC 33077

3 結(jié)論與討論

本研究利用單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)S.fibuligeraCICC 33077產(chǎn)淀粉酶條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株淀粉酶活力可達(dá)到12 297 U/g，高于目前文獻(xiàn)報(bào)道水平[31-32]，說(shuō)明該菌株產(chǎn)淀粉酶能力強(qiáng)，性能優(yōu)良。同時(shí)該菌株淀粉酶性質(zhì)研究結(jié)果表明，其淀粉酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH值為4.0，表明該菌株所產(chǎn)淀粉酶能夠在大曲發(fā)酵的酸性高溫環(huán)境中發(fā)揮作用，高效降解大曲中的淀粉顆粒，產(chǎn)生大量小分子糖，既能參與到美拉德反應(yīng)中，生成白酒風(fēng)味成分或前體物質(zhì)，豐富大曲風(fēng)味，又能供其他微生物的生長(zhǎng)繁殖，避免曲塊死板，起到促進(jìn)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)更替的作用，具有應(yīng)用于大曲生產(chǎn)的潛力。

本研究通過(guò)對(duì)高溫大曲中篩選出的高產(chǎn)淀粉酶S.fibuligera進(jìn)行產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)的研究，為菌株在白酒生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)利用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為穩(wěn)定不同地區(qū)、季節(jié)大曲品質(zhì)提供可能。