蔣娟娟，丁新怡，倪俊，董益陽*，陳浣，聞紅，劉佳蕙

1(北京化工大學 生命科學與技術學院，北京，100029) 2(北京市廣渠門中學，北京，100062) 3(北京大學 化學與分子工程學院，北京，100000)

改革開放40年來，我國人民生活質量有了顯著改善。肉及其制品富含營養(yǎng)，在食品精細化程度不斷加深和高收益的強烈誘惑下，食品違法行為也屢見不鮮[1-3]。目前在肉品質量監(jiān)控方面，世界各國制定了一系列政策措施，國際社會對肉品摻假的關注也不斷提高，2017年，在北京舉辦關于共同預防、控制以及治理食品摻假問題的“全球共識”研討會；我國國務院在《2017年食品安全重點工作安排》中也強調要推動“摻假造假行為直接入刑”等工作。基于此，食品肉類工業(yè)迫切需要一種快速、便攜、大眾化和可以實現(xiàn)商業(yè)化的檢測方法來完成自查和督查工作。

CAO等[4]使用酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)技術，聯(lián)用 SYBR green I(SG)可以實現(xiàn)未加工肉品的摻假, 也可以區(qū)分經過如煮沸、微波、高壓或油炸等深度加工肉品的種類；ALIA 等[5]對市場中的肉丸進行了研究，開發(fā)了基于納米生物綴合物的雜交動力學技術，通過功能化的標記金納米顆粒來檢測特定序列和單核苷酸錯配，以此來探索肉類來源，該方法具有較高的靈敏度。但是，在使用基于蛋白的方法來鑒別不同品系的肉品時，需要對靶蛋白的特異性和穩(wěn)定性進行全面考量；另外，蛋白質容易變性。因此，對于肉品摻假的鑒定研究工作仍然側重于基于核酸的分析方法[6-11]。

SOARES等[12]在家禽肉中混合已知量豬肉來構建二元混合肉制品，用 SYBR Green 為染料進行 RT-PCR 檢測，通過分析熔解曲線，驗證了該方法可應用于市場禽肉質量的檢測分析工作中；REN[13]通過對液滴數(shù)字 PCR(droplet digital PCR, ddPCR)分析技術的探究，對羊肉中有雞肉摻入的情況進行了定量檢測；同時，該工作也確定了在摻假比例不同時，拷貝數(shù)與混合肉類質量比率關系的轉換系數(shù)。雖然ddPCR技術是非常有應用價值的 DNA 定量檢測技術，但是，由于整個檢測過程處于微體系中，對液滴的操控水平要求極高，如何實現(xiàn)穩(wěn)定、高效且低成本的檢測，是第三代 PCR 技術從實驗基礎研究走向市場化亟待解決的問題。

HEBERT等[14]提出的DNA 條形碼技術(DNA barcoding)[15-16]，已在真菌、植物、魚類和兩棲類等多個類群的鑒別研究中得到應用。另一方面，隨著近些年對電化學傳感器研究力度的增強，DNA 傳感器便于攜帶、可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測和靈敏度高等優(yōu)點漸漸得到重視。例如，運用絲網印刷工藝，制成具有超小體積、質量幾可忽略、方便現(xiàn)場操作等特點的絲網印刷電極(screen printed electrode, SPE)，整個移動式檢測分析過程通過電纜線連接電腦即可完成，如圖1所示。該技術在 DNA-藥物相互作用機制的研究和評估、臨床診斷 DNA 堿基損傷、直接監(jiān)測雜交過程或特異性 DNA 序列的無標記檢測等[17]應用較多。

a-樣品托架；b-一次性絲網印刷電極；c-便攜式恒電位儀；d-傳感檢測軟件圖1 便攜式絲網印刷電極電化學傳感系統(tǒng)Fig.1 Portable SPE Electrochemical Sensor System

本課題將嘗試探索構建基于動物線粒體COI基因片段的絲網印刷電化學生物傳感器，如圖2所示，該過程無需經過繁瑣的 PCR 擴增過程，直接在電極工作界面通過寡核酸序列探針特異性捕獲靶序列，對樣品進行高特異性、高靈敏度和高適用性的分析測試，可實現(xiàn)原位檢測、高靈敏性、易商品化地快速鑒別肉品摻假目的，并完成混合二元靶 DNA 模型的定性與定量的相關工作，為我國關于禽肉、畜肉標準條形碼的確定和相關數(shù)據(jù)庫的建立，提供一種新的研究手段，也為相關法令條款的制訂與落實提供科學的數(shù)據(jù)支撐。

a-特異性探針的固定(藍線)；b-COI基因序列的雜交(綠線)；c-雙鏈DNA與亞甲基藍結合(紫點)；d-亞甲基藍方波伏安法電流信號圖2 利用特異性探針檢測生豬肉/牛肉混合二元物示意圖Fig.2 Illustration of the detection for pork/beef binary mixture with specific probe

1 材料與方法

1.1 試劑配制

分別配制 PBS 緩沖液(pH 7.4)、Tris-HCl 溶液(pH 8.0)和TE 緩沖液(pH 7.4)、 0.1 mol/L H2SO4溶液、1 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液、1 mmol/L ME 溶液、0.2% SDS 溶液、2.0×10-5mol/L MB 溶液以及1.0×10-3mol/L TCEP 溶液備用；按照合成說明，加入適量 TE 緩沖液配制成100 mmol/L DNA 合成液，4 ℃或-20 ℃冷凍保存。

1.2 定性PCR篩選肉品DNA條形碼序列

牛(BosTaurus)、羊(Ovisaries)、豬(Susscrofa)、雞(Gallusgallus)COI基因序列信息來源于：BOLD(NCBI)、Public Data Portal(CBOL)和參考文獻[18-19]；特異性引物通過 Nucleotide BLAST 和Primer 3設計以及篩選；所用通用引物參見文獻[20]。依次開展定性 PCR 擴增反應液配制、反應條件設定以及擴增產物的瓊脂凝膠電泳實驗。PCR 擴增實驗中所用序列均由上海生工公司合成。

1.3 COI-生物傳感器相關條件參數(shù)探究

本實驗采用的是探針自組裝的操作方式。(1)在使用前用1.0×10-3mol/L TCEP 溶液對DNA探針進行前處理，其中探針溶液和 TCEP 溶液的使用比率為1∶9(V/V)，探針通過其5′端二硫鍵和絲網印刷電極的金表面進行功能化連接，室溫孵育12 h；然后用0.2% SDS 溶液和 PBS 緩沖液(pH 7.4)反復沖洗后晾干絲網印刷電極；最后置于 ME 溶液(1mmol/L)中，避光處理1 h后用 PBS 緩沖液(pH 7.4)和超純水清洗表面，備用；(2)探針序列與靶序列的特異性雜交：用 TE 緩沖液將目標序列溶液稀釋，將處理好的電極浸入對應的目標 DNA 溶液(20 μL)中，用恒溫水浴鍋(45 ℃)孵育1 h，即可完成探針與目標序列的特異性雜交。反應結束后，用 PBS 緩沖液及超純水反復沖洗電極表面，室溫自然晾干，備用；(3)對傳感器電流信號值的讀取分析：將處理后的電極浸入在 MB 溶液(2.0×10-5mol/L，50 μL)中置于混勻振蕩器上20 min，幫助 MB 增加嵌入量；再將電極處于 PBS 緩沖液中，輕柔搖晃5 min后反復沖洗晾干。便攜式電化學工作站安裝好后，將電極轉入至PBS緩沖液中，并在SWV模式下進行電化學檢測。

2 結果與分析

2.1 篩選4種生肉品COI基因序列結果

由于禽肉和畜肉的條形碼技術在國內還處于起步階段，在肉品物種鑒定研究中，不同物種的“商標條形碼基因”仍未統(tǒng)一確定。因此，需要根據(jù)常見食用性肉品的不同物種進行初步篩選和電泳確證，為后續(xù)特異性探針的設計提供參考。2004年成立的生命條形碼聯(lián)盟(the Consortium for the Barcode of Life, CBOL)是物種分類條形碼的權威機構組織，通過其 Public Data Portal 基因庫，檢索雞肉、羊肉、豬肉、牛肉等相關4個代表性物種的 DNA 條形碼序列并進行引物設計，進行擴增以及擴增產物的凝膠電泳實驗，通過凝膠成像儀對條帶進行分析。

如圖3所示，當使用 DL2000 DNA Marker 時，生雞肉(條帶1～3)、生羊肉(條帶4)、生豬肉(條帶5)、生牛肉(條帶6)的線粒體COI基因經 PCR 擴增后的產物大小分別為150、210、200和230 bp，擴增結果與 Primer 3 系統(tǒng)預估產物長度(依次為：153，200，193，225 bp，)基本吻合且條帶重現(xiàn)性好。通過參考田晨曦等[21]設計的通用引物，對4條靶序列進行定性 PCR 擴增實驗和瓊脂糖凝膠電泳。

M-DL2000 DNA Marker;1～3-雞源性DNA擴增產物;4～6-分別為羊源性、豬源性和牛源性DNA擴增產物;7-空白對比圖3 雞肉、羊肉、豬肉、牛肉COI基因經PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 PCR-amplificated mt COI gene amplicons were analyzed by agarose gel electrophoresis

如圖4所示，當使用100 bp DNA Ladder(Dye Plus)時，生牛肉、生羊肉、生豬肉的COI基因經 PCR 擴增后的電泳條帶清晰且可重復性高；雞肉的擴增產物大小為920 bp，但電泳條帶較模糊(如圖4-d所示)，說明該部分采用的通用引物對物種G.gallus的COI基因特異性結合較弱。結果說明，所選COI基因序列具有高度保守區(qū)，有明顯物種代表性，基本符合 DNA 條形碼技術對理想標準條形碼的要求，可以作為后續(xù)實驗設計的靶標序列。

a-牛基因擴增產物(890 bp); b-羊基因擴增產物(530 bp);c-豬基因擴增產物(600 bp);d-雞基因擴增產物(920 bp)圖4 四種生肉COI基因的PCR擴增產物電泳結果Fig.4 PCR-amplification of mitochondrial COI gene

2.2 四種生肉品的檢測范圍及檢測限

本實驗分別對4種生肉品(雞肉、豬肉、牛肉和羊肉)的COI基因序列進行分析，分析濃度范圍為1.0×10-13～1.0×10-5mol/L的4種合成靶標序列在傳感工作平臺上的響應電信號變化，繼而建立各自 DNA 濃度(log C)與電化學指示劑 MB 還原電流差異變化(ΔI)間關系的曲線(如圖5所示)。

根據(jù)結果可以得知，在前期優(yōu)化的電化學條件下，靶標序列濃度范圍在10-13～10-5mol/L時，與還原峰電流差異ΔI(nA)呈現(xiàn)良好的線性關系，其線性方程分別為：雞肉的線性方程為ΔI=580.999 83+8 333.078 9 log C，線性相關系數(shù)為0.806 17；羊肉的線性方程為ΔI=203.125+6 658.12 log C，線性相關系數(shù)為0.786 77；豬肉的線性方程為ΔI=391.25+5 482 log C，線性相關系數(shù)為0.987 4；牛肉的線性方程為ΔI=720.625+10 521.45 log C，線性相關系數(shù)0.9613 6。

由于COI基因在線粒體基因組中，有時不會選用 AUG 或其中一種公認的翻譯規(guī)則來替代起始密碼子，而會經常使用未知方法來啟動翻譯，這種不尋常行為的頻率以及潛在的分子機制尚不清楚[22]，這給COI基因的研究工作增添了許多難度，對相關的檢測結果也有較難預期的影響。從實驗結果來看，豬肉和牛肉關系曲線的線性相關性較好。對無靶標序列修飾的電極進行10次平行 SWV 檢測，得到ΔI均值與標準偏差，再分別依據(jù)上述豬肉和牛肉的線性方程斜率求得相應的濃度值，因此，計算得出生豬肉檢測限為3.491×10-14mol/L，生牛肉的檢測限為5.048×10-14mol/L。因此，構建的COI-絲網印刷電極傳感器，能夠快速、簡便完成檢測工作，同時擁有較寬的檢測范圍，以及較低檢測限，能夠滿足市場對食品質量摻假的便攜、靈敏的檢測要求。

圖5 豬肉、羊肉、牛肉和雞肉COI基因序列梯度濃度對數(shù)值與MB雜交前后還原電流差異變化關系曲線(n=3)Fig.5 Relationship between logarithm of gradient concentration of raw meat and the difference of reduction current for MB hybridization (n=3)

2.3 混合二元物摻假模型響應曲線探究

為了進一步探究以牛源性修飾探針為生物識別元件與絲網印刷電極進行固定后構建的傳感器的可行性，將從大型超市購買的生豬肉和生牛肉攪碎均質制成肉泥；再將肉泥制備成不同比例的混合肉樣模型；提取混合樣品 DNA，并進行純度濃度檢測，備用；用 TE 溶液統(tǒng)一配制成濃度為 10-5mol/L 的靶標溶液，將探針與絲網印刷電極進行一系列組裝和孵育，然后對生豬肉/牛肉混合二元物模型進行電化學傳感檢測分析。

如圖6所示，不同質量的混合肉品提取的 DNA 與牛源性探針雜交后，通過電化學指示劑亞甲基藍的嵌入，雜交信號可以成功轉化為電流信號。取50 ng混合樣品時，雜交特異性最強，隨著混合生肉品的質量減少，亞甲基藍的電流信號穩(wěn)定性逐漸降低，圖形開始出現(xiàn)波動，出現(xiàn)該種情況的原因可能是由于目標序列的濃度逐漸減少，在電極工作表面同探針進行特異性結合的 ssDNA 也隨之減少，使得 MB 有效嵌入量減少，故最終電化學信號降低也較顯著。

a-靶標DNA取自50 ng混合肉樣; b-靶標DNA取自30 ng混合肉樣; c-靶標DNA取自20 ng混合肉樣圖6 生牛肉中分別摻入質量分數(shù)100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 3%, 1%和0.1%生豬肉時DNA檢測的峰值電流與摻混比例的對應圖Fig.6 Peak current versus adulteration ratio of bovine DNA consisting 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 3%, 1% and 0.1% (w/w%) of porcine DNA, respectively

從圖6可以得出，當混合生肉量為50 ng時，靶標 DNA 與探針特異性結合后，指示劑 MB 的電信號更加穩(wěn)定；同時，雖然靶標 DNA 的濃度不同，但是從最終的電信號峰值來看，除摻混比例25%的數(shù)據(jù)普遍有點異常有待進一步探明原因外，方法對混合二元物的識別能力幾乎不受摻假比例影響。

綜上可知，利用牛源性物種Bosgruuniens的COI基因設計的特異性探針，經過適當?shù)男揎?，構建COI-絲網印刷電極傳感平臺用于識別生豬肉/牛肉的混合二元物摻假是可行的，這為實際生豬肉/牛肉摻假或因非人為因素偶然攜入的檢測工作提供了新的研究思路。

2.4 與實時PCR技術的特性比對

聚合酶鏈式反應(traditional PCR)是現(xiàn)階段應用最廣泛的生物分子定性技術之一。在常見的食品摻假事件中，為了達到定量肉品摻假的鑒別要求，發(fā)展出了第二代 PCR 技術，其中實時 PCR 或熒光PCR技術(Real-time PCR, RT-PCR)是現(xiàn)在肉類摻假鑒別的主流技術，也是現(xiàn)階段國內許多檢測機構公認的定量檢測手段。為了更好地體現(xiàn)本工作中首次構建的基于動物線粒體COI基因的電化學傳感平臺的檢測優(yōu)勢，本文對該技術與實時PCR技術進行了小結和比較(如表1所示)。

表1 電化學傳感技術與實時定量PCR檢測技術比較Table 1 Comparison of electrochemical sensing technology and RT-PCR detection technology

通過2種檢測方法的比較可知，實時 PCR 技術和電化學傳感技術均可以完成對生豬肉/牛肉混合二元物的鑒定工作，前者現(xiàn)階段運用成熟，但是后者在儀器成本、配套設施、響應時間等方面更具分析優(yōu)勢，也更加適合低比例摻假和現(xiàn)場快速檢測要求，故在肉品真?zhèn)舞b別中具有較大的市場開發(fā)潛力。

3 結論

為了快速便捷的實現(xiàn)肉品真?zhèn)舞b別，本文首次以動物線粒體COI基因為識別元件，以一次性絲網印刷生物傳感器為器件，成功搭建鑒別豬肉和牛肉混合二元物的電化學傳感檢測平臺，檢測可免去復雜的分子擴增中間實驗、成本更低、操作技術更加簡便化，具有良好的鑒別靈敏度和商業(yè)應用前景，是目前主流的實時PCR技術的重要補充。本文所介紹的絲網印刷電極電化學傳感技術也可為動物COI基因條形碼相關研究提供新的思路和數(shù)據(jù)支持。