王斯維，王棟，陶玲玲，徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

在釀造酒行業(yè)中，氨基酸不僅能賦予釀造酒鮮、甜、苦、澀等多種味覺特征，同時(shí)還為發(fā)酵過程中酵母等微生物的生長代謝提供氮源，促進(jìn)發(fā)酵作用[1-3]，因此氨基酸含量水平是食品發(fā)酵工業(yè)中一個(gè)重要的指標(biāo)[4]。氨基酸水平通常以氨基酸態(tài)氮進(jìn)行表征，以衡量原料蛋白質(zhì)的水解程度、發(fā)酵液的氮源水平及產(chǎn)品質(zhì)量等。

在食品發(fā)酵領(lǐng)域，氨基酸態(tài)氮的常用測定方法是甲醛滴定法和茚三酮比色法。甲醛滴定法常用于黃酒、醬油等產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮的測定[5-6]，該方法通過甲醛結(jié)合氨基，使氨基酸顯酸性，進(jìn)而通過標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液對其進(jìn)行定量。甲醛滴定法雖然操作簡單，但甲醛為一類致癌物[7]，且該方法檢測限較高[8]，常用于對氨基酸含量較高的產(chǎn)品進(jìn)行檢測。茚三酮比色法是啤酒等產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮的測定方法[9-10]，也常用于測定茶葉等食品中游離氨基酸總量[11]，是一種操作方便、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度都比較高的分析方法。此外，氨基酸的分析也可通過基于色譜技術(shù)的氨基酸分析儀，利用衍生物質(zhì)與氨基酸的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)氨基酸分析，該方法能準(zhǔn)確定量樣品中近20種常見的游離氨基酸，但是成本較高，操作較為繁瑣[12]。已有研究比較了甲醛滴定法與茚三酮比色法對特定產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮的測定[8, 13]，結(jié)果表明，這2種方法均具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，但測定結(jié)果有一些差異。此外，茚三酮比色法雖然不能檢測脯氨酸等氨基酸，但相對于甲醛滴定法，其檢測限更低，測定濃度范圍更廣[8]?？傮w而言，2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，對于不同的測定目的，應(yīng)選擇合適的測定方法。

目前黃酒中氨基酸態(tài)氮的測定在國際上采用的是甲醛滴定法[5]。但是，近年來清爽型黃酒以及米酒逐漸受到市場的歡迎，而這些產(chǎn)品中氨基酸含量相對較低，利用甲醛滴定法測定某些清爽型黃酒，測定結(jié)果誤差可能相對較大。特別是一些米酒產(chǎn)品，利用酒藥(小曲或米曲)而不是麥曲作為糖化發(fā)酵劑進(jìn)行釀造，氨基酸含量相對更低，甲醛滴定法是否可以準(zhǔn)確地測定其中的氨基酸態(tài)氮含量，成為目前出現(xiàn)的問題。

本研究通過對黃酒和米酒中氨基酸態(tài)氮不同測定方法的比較，重點(diǎn)探討了茚三酮比色法在米酒和黃酒等中國傳統(tǒng)釀造酒中的適用性，為米酒行業(yè)中氨基酸態(tài)氮分析指標(biāo)的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

本研究所用黃酒和米酒樣品均為市售商品或由生產(chǎn)廠家提供的產(chǎn)品，包括9個(gè)黃酒樣品和8個(gè)米酒樣品，共17個(gè)。產(chǎn)地來源以浙江、江蘇、上海和湖北為主，產(chǎn)品類型涉及干、半干、半甜和甜型等各種類型，酒精度范圍為5%～18%vol。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醛水溶液、乙醇、酚酞、NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、Na2HPO4、KH2PO4、水合茚三酮、果糖、碘酸鉀、甘氨酸四氫呋喃、三乙胺、鹽酸、結(jié)晶乙酸鈉、三氯乙酸：分析純，上海國藥集團(tuán)；甲醇、乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20型pH計(jì)，瑞士Mettler Toledo；CYTATION3型酶標(biāo)儀，BioTek公司；Centrifuge 5810R型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Agilent1100型高效液相色譜儀系統(tǒng)，美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酒樣處理

取酒樣40 mL于50 mL離心管中，4 ℃下8 000 r/min離心5 min后，取上清作為實(shí)驗(yàn)試樣，存放于4 ℃冰箱備用。

樣品酸度調(diào)節(jié)：先以0.5 mol/L的NaOH溶液對樣品進(jìn)行中和處理，調(diào)節(jié)樣品pH至8.20，然后添加適量乳酸調(diào)節(jié)處理后的樣品，達(dá)到所需的總酸含量(以乳酸計(jì))。

樣品乙醇濃度調(diào)節(jié)：利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃、100 hPa壓力下對酒樣進(jìn)行減壓蒸餾處理0.5～1 h去除乙醇，然后加入適量無水乙醇調(diào)節(jié)處理后樣品中的乙醇含量至所需要的水平。

1.3.2 測定分析方法

甲醛滴定法參照黃酒國標(biāo)GB/T 13662—2018[5]。

茚三酮比色法參照啤酒工業(yè)手冊[9]并略加改進(jìn)。將酒樣稀釋100倍后取稀釋酒樣2.00 mL，置于10 mL離心管中，加顯色劑1.00 mL，搖勻，在恒沸水浴中準(zhǔn)確加熱16 min后，于20 ℃水浴中冷卻20 min，加5 mL KIO3稀釋溶液，搖勻，用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定其吸光度(OD值)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用不同濃度的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度范圍為1.60～53.57 mg/L)進(jìn)行上述操作測定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

氨基酸分析儀采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測法[14]。樣品處理：樣品經(jīng)三氯乙酸沉淀后靜置0.5 h，取上清過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，濾液進(jìn)樣。色譜條件：色譜柱為Agilent Hypersil ODS柱，流動(dòng)相A為27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)，流動(dòng)相B為80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2)，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋? min，8%B；17 min，50%B；20.1 min，100%B；24.0 min，0%B；流動(dòng)相流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；紫外檢測器(VWD)檢測波長為338 nm，其中脯氨酸在262 nm波長下檢測。

氨基酸態(tài)氮計(jì)算。根據(jù)氨基酸分析儀測得的各氨基酸含量及其所含的氨基酸態(tài)氮、α-氨基酸態(tài)氮分別進(jìn)行換算得到總氨基酸態(tài)氮和α-氨基酸態(tài)氮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒和米酒特性對茚三酮比色法測定氨基酸態(tài)氮的影響

茚三酮比色法是啤酒行業(yè)中氨基酸態(tài)氮測定的標(biāo)準(zhǔn)方法[9-10]。與啤酒相比，黃酒和米酒在一些特性上存在著較大差異，如黃酒色澤較深，乙醇和總酸含量遠(yuǎn)高于啤酒等，因此，首先對黃酒和米酒的這些特性是否會(huì)影響茚三酮比色法的測定結(jié)果進(jìn)行了探究。

2.1.1 色澤對茚三酮比色法測定的影響

茚三酮比色法較為靈敏，在測定啤酒樣品時(shí)需要進(jìn)行100倍左右的稀釋[15]。黃酒酒液由于顏色較深，可能會(huì)對茚三酮比色法的結(jié)果產(chǎn)生干擾[16]。因此，參考啤酒樣品的處理方法，首先對黃酒和米酒樣品進(jìn)行100倍稀釋處理，對稀釋前后的所有樣品在400～700 nm之間進(jìn)行全波長掃描，主要對各樣品570 nm波長處測定的OD值進(jìn)行分析，考察黃酒和米酒色澤是否對茚三酮比色法的測定有影響。結(jié)果如圖1所示，黃酒樣品在570 nm處的OD值平均在0.20左右，高的可達(dá)0.35，而米酒樣品的OD值相對較低。由于比色法需要對樣品進(jìn)行稀釋處理，在稀釋100倍后，黃酒和米酒樣品的OD值均降低至0.037～0.041，與純水的吸光度接近，因此可以認(rèn)為黃酒和米酒的色澤在茚三酮比色法的測定中不會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。

2.1.2 總酸對茚三酮比色法測定的影響

黃酒或米酒中總酸(以乳酸計(jì))一般在10 g/L以下，隨機(jī)選取黃酒和米酒樣品各1個(gè)，調(diào)節(jié)樣品中的總酸含量為0 ～20 g/L，利用茚三酮比色法測定不同酸度下樣品的氨基酸態(tài)氮。結(jié)果如表1所示，不同酸度對2個(gè)樣品中比色法測定值的相對偏差基本小于3.00%，最高為5.19%，因此可以認(rèn)為黃酒或米酒的酸度不會(huì)對茚三酮比色法的測定結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。

A-黃酒稀釋前的OD值；B-米酒稀釋前的OD值；C-黃酒稀釋后的OD值；D-米酒稀釋后的OD值；E-570 nm處黃酒OD值；F-570 nm處米酒OD值圖1 稀釋前后黃酒和米酒OD值的變化Fig.1 Changes in OD values of Huangjiu and Mijiu before and after dilution

表1 總酸對氨基酸態(tài)氮測定結(jié)果的影響Table 1 Effect of total acid content on the determination of amino acid nitrogen

注：a為對照值，b、c分別為不同酸度下樣品3次測定值的平均值及其與對照值的相對偏差。

2.1.3 酒精含量對茚三酮比色法測定的影響

相對于啤酒，黃酒和米酒的酒精度要高出很多，黃酒中酒精度一般為8%～18%vol。隨機(jī)選取黃酒和米酒樣品各1個(gè)，調(diào)節(jié)樣品中的酒精度為0～25.35%vol，利用茚三酮比色法測定不同乙醇含量酒樣的氨基酸態(tài)氮。結(jié)果如表2所示，不同乙醇含量對2個(gè)樣品中比色法測定值的相對偏差均較小，最大為4.27%，因此可以認(rèn)為黃酒或米酒的酒精含量不會(huì)對茚三酮比色法的測定結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。

2.2 茚三酮比色法和甲醛滴定法精密度和準(zhǔn)確性比較

由于黃酒或米酒的色澤、總酸及酒精含量等特性不會(huì)對茚三酮比色法的測定結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，進(jìn)一步對該方法測定黃酒和米酒氨基酸態(tài)氮的精密度和準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn)，并與甲醛滴定法進(jìn)行比較，結(jié)果如表3和表4所示。

表2 酒精含量對比色法測定結(jié)果的影響Table 2 Effect of alcohol content on the determination of amino acid nitrogen

注：a為對照值，b、c分別為不同酒精含量下樣品3次測定值的平均值及其與對照值的相對偏差。

對于氨基酸態(tài)氮含量相對較高的樣品(如樣品2)，2種測定方法的精密度和準(zhǔn)確性均較好，RSD值(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)均小于2.00%，加標(biāo)回收率也接近100%。但對于氨基酸態(tài)氮含量相對較低的樣品(如樣品1)，滴定法的精密度較差，RSD值為12.58%，且由于測定的重復(fù)性較差，因此加標(biāo)回收率的變化也較大，而比色法仍表現(xiàn)出較好的精密度和準(zhǔn)確性。該結(jié)果與這2種方法在鮮味提取物[17]和膠原水解物[8]中氨基酸態(tài)氮的測定結(jié)果相類似。由于滴定法所固有的誤差，當(dāng)樣品氨基酸態(tài)氮含量較低(滴定值較小)時(shí)，其相對誤差較大，因而精密度和準(zhǔn)確性相對較低。因此在測定含量相對較低的樣品(如米酒樣品)時(shí)，比色法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性更高。

表3 茚三酮比色法和甲醛滴定法的精密度檢驗(yàn)Table 3 Precision test of ninhydrin colorimetry and formaldehyde titration

表4 茚三酮比色法和甲醛滴定法的準(zhǔn)確性檢驗(yàn)Table 4 Accuracy test of ninhydrin colorimetry and formaldehyde titration

2.3 茚三酮比色法和甲醛滴定法測定黃酒和米酒中氨基酸態(tài)氮的結(jié)果比較

在明確了茚三酮比色法測定黃酒和米酒中氨基酸態(tài)氮的可行性后，對來自不同產(chǎn)地、不同類型的9個(gè)黃酒樣品和8個(gè)米酒樣品分別利用茚三酮比色法和甲醛滴定法進(jìn)行氨基酸態(tài)氮的測定，并與利用氨基酸分析儀測定各酒樣中17種氨基酸的定量結(jié)果進(jìn)行比較分析。氨基酸分析儀測定的黃酒和米酒氨基酸含量結(jié)果如表5所示。

表5 黃酒和米酒中氨基酸分析儀測定的脯氨酸及總氨基酸含量Table 5 Content of proline and total amino acid in Huangjiu and Mijiu

首先對茚三酮比色法和甲醛滴定法的測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2-A所示，兩者對米酒和黃酒的測定結(jié)果具有很好的線性相關(guān)性(R2=0.983 1)，但滴定法的測定結(jié)果明顯高于比色法(斜率為1.371 8)。在表5中也比較了米酒和黃酒中根據(jù)氨基酸分析儀測定結(jié)果計(jì)算得到的總氨基酸態(tài)氮和α-氨基酸態(tài)氮含量，可以發(fā)現(xiàn)，相同樣品總氨基酸態(tài)氮含量比α-氨基酸態(tài)氮含量平均要高50%左右。一般認(rèn)為，甲醛滴定法的測定結(jié)果為總的氨基酸態(tài)氮含量，而茚三酮比色法的測定結(jié)果主要為α-氨基酸態(tài)氮含量(不含α-亞氨基酸，如脯氨酸和羥脯氨酸)[13,18]，因?yàn)樵?70 nm處一些非α-氨基酸，如脯氨酸等與茚三酮的反應(yīng)產(chǎn)物無明顯吸收，無法被定量[19]，因此甲醛滴定法的測定值通常會(huì)高于茚三酮比色法[8]。黃酒和米酒中含有較高含量的脯氨酸(表5)，約占總氨基酸含量的10%，進(jìn)一步比較了比色法測定值加上脯氨酸態(tài)氮后與滴定法測定值的差異，結(jié)果如圖2-B，兩者的線性相關(guān)性仍然很好(R2=0.987 3)，但斜率下降至1.204 0，即兩者的差異縮小，表明脯氨酸的確是引起滴定法的測定結(jié)果高于比色法的一個(gè)重要原因。同時(shí)，由于黃酒和米酒中其他含氨基化合物，包括氨和胺類等化合物也都可能與甲醛進(jìn)行反應(yīng)進(jìn)而被測定，使得甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮的結(jié)果偏高[20]。因此，雖然茚三酮比色法和甲醛滴定法的測定結(jié)果具有較好的相關(guān)性，但由于2種測定方法存在的差異，針對不同的目的和對象，應(yīng)該選擇適當(dāng)?shù)臏y定方法。

A-比色法與滴定法測定值的直接比較；B-比色法測定值中加入脯氨酸計(jì)算值與滴定法的比較圖2 比色法和滴定法的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between ninhydrin colorimetry and formaldehyde titration

由于米酒的氨基酸態(tài)氮含量遠(yuǎn)低于黃酒(表5)，進(jìn)一步根據(jù)氨基酸分析儀測定結(jié)果，計(jì)算各酒樣中總氨基酸態(tài)氮和α-氨基酸態(tài)氮的含量，分別對黃酒和米酒茚三酮比色法和甲醛滴定法的測定結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，滴定法的測定結(jié)果更接近于總氨基酸態(tài)氮的計(jì)算含量(圖3-A、B)，其斜率相比比色法更接近于1；而比色法的測定結(jié)果則更接近于α-氨基酸態(tài)氮的計(jì)算含量(圖3-C、D)，這與之前的分析結(jié)果一致，即甲醛滴定法的測定結(jié)果為總的氨基酸態(tài)氮含量，茚三酮比色法的測定結(jié)果主要為α-氨基酸態(tài)氮含量[18]。從線性關(guān)系來看，無論是總氨基酸態(tài)氮還是α-氨基酸態(tài)氮，與比色法相比，滴定法的測定值與氨基酸分析儀的計(jì)算值線性關(guān)系相對較差(R2相對更小)，特別是對于氨基酸含量相對更低的米酒，比色法的測定值偏差較小，與氨基酸分析儀計(jì)算值的線性關(guān)系相對更好(圖3-C、D)，說明比色法與氨基酸分析儀的測定結(jié)果一致性更高。比色法雖然不能測定脯氨酸等氨基酸，但可以測定幾乎所有α-氨基酸態(tài)氮及少量其他氨態(tài)氮[21]；而氨基酸分析儀通常只能定量樣品中接近20種游離氨基酸，并非所有氨基酸。兩者測定的對象不完全相同，但絕大部分是一致的。與這2種方法相比，滴定法的測定對象則更為復(fù)雜。因此這可能是比色法與氨基酸分析儀測定結(jié)果有更好相關(guān)性的主要原因。

A-黃酒總氨基酸態(tài)氮結(jié)果比較；B-米酒總氨基酸態(tài)氮結(jié)果比較；C-黃酒α-氨基酸態(tài)氮結(jié)果比較；D-米酒α-氨基酸態(tài)氮結(jié)果比較圖3 比色法、滴定法測定結(jié)果分別與氨基酸分析儀計(jì)算結(jié)果的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between colorimetric method as well as titration method and amino acid analyzer

氨基酸態(tài)氮是黃酒的產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)之一，同時(shí)氨基酸也賦予了釀造酒鮮、甜、苦、咸等多種味感，使酒體具有更加豐富的味覺層次，脯氨酸也是黃酒和米酒中重要的甜味貢獻(xiàn)物[19]。實(shí)際上，由于氨基酸態(tài)氮各種方法測定的原理和對象不同，測定結(jié)果存在一定的差異。因此，根據(jù)不同的目的和要求，應(yīng)該采用不同的測定方法。滴定法的測定結(jié)果更能反映產(chǎn)品總體的氨基酸水平。而在釀造過程中，酵母主要通過對游離氨基酸的利用進(jìn)行生長代謝，而脯氨酸和羥脯氨酸幾乎不被酵母利用[22]，因此比色法的測定結(jié)果更能表征影響發(fā)酵過程的α-氨基氮含量。此外，如果比色法采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，可同時(shí)對數(shù)十個(gè)微量樣品進(jìn)行分析，對大量樣品的快速測定具有優(yōu)勢。

3 結(jié)論

本研究主要考察了茚三酮比色法在黃酒和米酒氨基酸態(tài)氮測定中的適用性。研究結(jié)果表明，黃酒和米酒的色澤、總酸和酒精度等特性對茚三酮比色法的測定結(jié)果無顯著影響。茚三酮比色法與甲醛滴定法測定結(jié)果之間具有較好的線性關(guān)系，但甲醛滴定法測定值相對偏高。黃酒和米酒中脯氨酸及其他含氨基化合物，包括氨和胺類等化合物可能是造成兩者測定結(jié)果差異的主要原因。

雖然甲醛滴定法目前是黃酒行業(yè)通用的氨基酸態(tài)氮測定方法，但對米酒等氨基酸態(tài)氮含量較低的樣品測定時(shí)，茚三酮比色法則具有較高的精密度和準(zhǔn)確性。對照氨基酸分析儀分析結(jié)果，甲醛滴定法更適于表征產(chǎn)品的總體氨基酸含量，而茚三酮比色法則能更準(zhǔn)確反映發(fā)酵過程中的α-氨基酸含量。此外，茚三酮比色法作為一種在測定低氨基酸態(tài)氮時(shí)具有同樣高可靠性的方法，還可在較短時(shí)間內(nèi)對大批量樣品進(jìn)行快速測定，具有安全、低成本、易操作等優(yōu)點(diǎn)，適合在釀造行業(yè)生產(chǎn)及科研中推廣。該方法不僅是對黃酒的氨基酸態(tài)氮測定方法的補(bǔ)充，還可為米酒行業(yè)氨基酸態(tài)氮分析指標(biāo)的建立提供依據(jù)。