畢生雷，王林風，趙明星，劉鉞，喬建援，鄭彬

1(河南天冠企業(yè)集團有限公司，車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南 南陽，473000) 2(江南大學 環(huán)境與土木工程學院，江蘇 無錫，214122)

生物柴油是一種清潔能源，可以通過油料作物種植、微生物發(fā)酵、地溝油回收利用等方式獲得[1]。油料作物種植占地面積廣、生長周期長，而地溝油價格昂貴、回收困難，尚不能完全滿足生物柴油生產(chǎn)的需要[2]。利用小球藻、圓紅冬孢酵母等高含油微生物生產(chǎn)生物柴油已成為重要的研究領(lǐng)域。異養(yǎng)小球藻(Heterotrophicchlorella)不僅可以用來產(chǎn)油脂，也可以用來生產(chǎn)藻粉、餌料、葉黃素、藻蛋白、小球藻生長因子等高附加值產(chǎn)物而備受重視[3-4]。

根據(jù)廢水生成和組分特點，小球藻生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢水可以分為兩大類。一是對小球藻發(fā)酵液直接進行固液分離后得到發(fā)酵上清液；二是對小球藻進行產(chǎn)品提取后得到提取廢液(可以對發(fā)酵液直接進行提取，也可以對離心后得到的藻泥進行提取)，包括葉黃素提取廢液、藻蛋白提取廢液、提油廢水等。發(fā)酵上清液中的成分較為復雜，來源多樣化，主要包括剩余的營養(yǎng)鹽、藻細胞自身代謝產(chǎn)生的有機酸與堿液中和形成的有機酸鹽、細胞自溶產(chǎn)生的細胞碎片、藻油等[5]。盡管發(fā)酵上清液中的成分種類較多，但是研究表明，發(fā)酵上清液具有較好的回用潛力。例如，韓士群等研究表明，異養(yǎng)小球藻細胞在自溶時會釋放出對細胞生長有促進作用的小球藻生長因子[6]。吳娟等發(fā)現(xiàn)，使用異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液上清液替代30%的配料用水能夠提高異養(yǎng)小球藻生物量[7]。與發(fā)酵上清液相比，小球藻提取廢液隨下游產(chǎn)品不同而性質(zhì)差異顯著。本文主要關(guān)注熱酸解提油廢水回用的可行性。

熱酸解法是成本、能耗較低的異養(yǎng)小球藻油脂的提取方法。提取時，需要直接向發(fā)酵液中加入小球藻干重1/7的濃H2SO4，然后經(jīng)熱酸解、萃取、相分離、離心等操作分別得到熱酸解提油廢水和藻油(圖1)。通常情況下，熱酸解提油廢水占發(fā)酵液體積的90%左右，且pH為1.0左右，還含有油、酸、鹽、醇等復雜成分的多相體系，處理難度極大[8-9]。目前異養(yǎng)小球藻下游提取廢水的處理方法主要包括膜分離法、絮凝法、吸附法等物理化學方法，以及活性污泥法、生物膜法等生物方法。這些方法在實際應用時存在著成本高、能耗大等局限性，往往需要多種方法結(jié)合起來使用才能使出水水質(zhì)達到排放要求[8]。本文將對異養(yǎng)小球藻熱酸解提油廢水回用工藝進行初步探討，以達到削減下游污水處理量、降低污水處理成本的目的。

圖1 熱酸解法提油廢水制備流程Fig.1 Preparation process of oil extraction wastewater by heating acidolysis

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

異養(yǎng)小球藻藻種，清華大學生命科學院提供。異養(yǎng)小球藻熱酸解法提油廢水，車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室提供。實驗所用化學試劑均為分析純，國藥集團。

SPX-150A/B型生化培養(yǎng)箱，杭州綠博；ZWY-111B型恒溫震蕩培養(yǎng)器，上海智城；XSP-9CA型顯微鏡，上海光學儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱酸解提油廢水的獲得

異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液經(jīng)熱酸解、萃取、離心，從而獲得水相(圖1)[10]。水相體積約為熱酸解液體積的90%，水相中含有未利用完全的培養(yǎng)基成分、小球藻代謝產(chǎn)物、H2SO4、部分萃取劑殘留(乙醇、正已烷)等。水相再次離心后，取上清液，調(diào)節(jié)pH至7.0后備用。

1.2.2 搖瓶種子培養(yǎng)條件

平板挑一環(huán)藻細胞接入搖瓶，200 r/min，28 ℃培養(yǎng)7 d，種子培養(yǎng)合格時種子液中應無菌、干重達到10 g/L以上[1,11]。

1.2.3 搖瓶培養(yǎng)方法

1.2.3.1 搖瓶發(fā)酵控制條件

初始pH 6.5，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，搖床溫度28 ℃，接種體積分數(shù)為10%。

1.2.3.2 配料用水

對照組配料用水全部為自來水，實驗組配料水為自來水加不同比例的熱酸解提油廢水，提油廢水的添加體積分數(shù)分別為5%、10%、15%、20%、30%、40%、60%。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)：葡萄糖30、酵母粉3、K2HPO4·3H2O 0.075、MgSO4·7H2O 0.075、CaCl2·2H2O 0.025、KH2PO40.175，其他微量營養(yǎng)鹽若干[1,11]。

1.2.5 分析方法[1,11]

葡萄糖含量采用HPLC法測定；細胞數(shù)采用血球板計數(shù)；干重測定方法：取10 mL發(fā)酵液，離心后棄上清液，加蒸餾水至10 mL洗滌，再次離心棄上清液，反復操作2次，100 ℃烘干藻泥，然后計算干重。

(1)

式中：A,發(fā)酵液烘干后質(zhì)量，g；B,發(fā)酵液體積，L。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

使用origin75繪圖并分析。

2 結(jié)果與討論

熱酸解提油廢水中既含有小球藻生長因子，又含有可能對小球藻生長產(chǎn)生抑制的物質(zhì)，如殘留的萃取劑、各種鹽、油脂等。本文分別通過檢測藻細胞干重、發(fā)酵液中葡萄糖含量等指標來考察提油廢水回用對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵的影響。

2.1 熱酸解提油廢水回用對異養(yǎng)小球藻干重的影響

生物量是某一時刻單位空間內(nèi)特定微生物的個體數(shù)或質(zhì)量，能夠反映微生物的生長程度。干重是生物量檢測方法中較為直觀、結(jié)果較為穩(wěn)定的一個。排除雜質(zhì)的影響，異養(yǎng)小球藻的干重主要受到細胞數(shù)量、細胞內(nèi)蛋白和油脂含量的影響。

如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的推移，各實驗組干重均比發(fā)酵初期有不同程度的增加。當熱酸解提油廢水的回用比例為5%、10%、15%時，相同發(fā)酵時間內(nèi)實驗組干重增加幅度均高于對照組。其中，回用比例為5%、10%時，實驗組在前4 d的干重增長與對照組保持一致；4 d后，對照組干重停止增長，而這2組的干重仍在穩(wěn)定增加。當熱酸解提油廢水回用比例超過15%時，隨著廢水回用比例的不斷增加，發(fā)酵終了細胞干重持續(xù)下降，分別為對照組的95.86%、63.79%、44.12%和10.20%。

圖2 不同回用比例對發(fā)酵液干重的影響Fig.2 Effect of different reuse ratio on dry weight of fermentation broth

與提油廢水相比，發(fā)酵液上清液的回用比例更高。據(jù)報道，上清液回用比例可達30%，且在發(fā)酵第4天時，干重即達到最大值13.4 g/L[7]。而采用熱酸解提油廢水回用時，最佳回用比例為10%，發(fā)酵終了干重僅12.02 g/L。原因在于，上清液回用時僅簡單離心去除藻細胞，保留了大量的代謝產(chǎn)物、部分質(zhì)量較小的細胞碎片和膠體等，從而導致在發(fā)酵末期，因營養(yǎng)不足、搖瓶溶氧不足藻細胞停止生長[12]。而熱酸解提油廢水回用時經(jīng)過反復離心，廢水中僅含有代謝產(chǎn)物、醇等物質(zhì)，固形物雜質(zhì)基本不存在，而且發(fā)酵過程中干重一直沒有上清液回用時高，因此沒有出現(xiàn)溶氧不足而影響藻細胞生長的現(xiàn)象。之所以出現(xiàn)生物量比上清液回用低是因為，熱酸解提油廢水pH僅為1，在使用前用堿中和，與上清液相比，廢水中不僅有代謝產(chǎn)物、殘余的萃取劑，還因酸堿中和增加了鹽濃度，導致發(fā)酵液滲透壓增加，影響藻細胞利用營養(yǎng)物質(zhì)的效率[13]。上清液回用和熱酸解廢水回用均能夠提高干重，對照組停止生長后實驗組仍能繼續(xù)生長，說明兩者均含有能夠促進藻細胞生長的物質(zhì)。

綜上，回用比例為5%、10%時，異養(yǎng)小球藻的生長得到促進，最終生物量提高；回用比例為15%時，異養(yǎng)小球藻生長得到抑制，但生物量持續(xù)增長，最終生物量仍然比對照組有所提高；而當回用比例超過20%時，異養(yǎng)小球藻的生長得到抑制，最終生物量下降。

2.2 回用提油廢水對發(fā)酵液pH值的影響

發(fā)酵過程中pH值不斷發(fā)生變化，因此必須監(jiān)控并調(diào)節(jié)好發(fā)酵過程中的pH值，否則將會對微生物的細胞膜透性、氧化-還原電位、酶活性造成影響[14]。pH值變化的原因包括培養(yǎng)基滅菌，微生物代謝，培養(yǎng)基中氨基酸和磷酸鹽、銨鹽的消耗，發(fā)酵后期細胞死亡，自溶[15-17]。研究發(fā)酵液pH值變化有助于整體把控發(fā)酵過程。

為了提高異養(yǎng)小球藻產(chǎn)油能力和生長速度，培養(yǎng)基中的氮源一般使用酵母粉等有機氮以及葡萄糖等能夠被細胞快速利用的碳源，但培養(yǎng)基滅菌時，有機氮中的氨基酸和還原糖在高溫條件下易發(fā)生美拉德反應，從而造成還原糖損失、pH值下降[18]。如圖3所示，在發(fā)酵初期，各實驗組的pH值沒有明顯差異，說明在培養(yǎng)基滅菌前后回用提油廢水對發(fā)酵液影響不大。

圖3 不同回用比例對發(fā)酵液pH值的影響Fig.3 Effect of different reuse ratio on pH of fermentation broth

隨著發(fā)酵時間的推移，回用比例為40%和60%的實驗組，發(fā)酵液pH值不斷緩慢上升，回用比例30%實驗組pH值沒有明顯變化，回用比例20%實驗組pH值一直處于下降過程中，而其他實驗組pH值均是先下降再上升，其中對照組pH下降最快，在發(fā)酵第3天即達到最低然后開始上升，回用比例5%、10%和15%實驗組則在第4天才開始上升。因此可以認為，熱酸解法提油廢水的回用不會影響培養(yǎng)基的主要成分，但能夠影響藻細胞的正常生長。

在發(fā)酵液上清液回用實驗中，回用30%比例的上清液，發(fā)酵過程中pH在發(fā)酵初期下降，發(fā)酵第3天達到最低然后緩慢上升，但上升緩慢，而本實驗熱酸解提油廢水回用比例10%實驗組發(fā)酵第4天pH才開始上升，pH上升速度較快，說明回用發(fā)酵液上清液藻細胞活性更強，細胞死亡、自溶速度更慢。原因可能是發(fā)酵液上清液中刺激細胞生長、維持細胞活性的物質(zhì)含量更大。

實驗表明，熱酸解法提油廢水中含有抑制藻細胞新陳代謝的物質(zhì)。對照組在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的有機酸，在發(fā)酵中后期率先將培養(yǎng)基中的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)消耗完，從而引起細胞自溶、pH值上升[19]?；赜帽壤秊?0%、60%時，提油廢水回用對藻細胞影響較大，可能是受滲透壓影響藻細胞吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)困難，從而導致生長代謝停滯甚至細胞緩慢死亡；回用比例為20%、15%時，提油廢水回用對藻細胞有一定影響，藻細胞生長緩慢，發(fā)酵過程代謝水平降低、產(chǎn)酸量減少；回用比例為5%和10%實驗組提油廢水回用對藻細胞影響較小，發(fā)酵過程代謝產(chǎn)酸與對照組接近，而且細胞死亡、自溶較少。

2.3 回用提油廢水對發(fā)酵液葡萄糖含量的影響

葡萄糖是活細胞的能量來源，異養(yǎng)小球藻發(fā)酵的過程實質(zhì)上是分解葡萄糖并在酵母粉的刺激下將其轉(zhuǎn)化為油脂儲存在藻細胞內(nèi)的過程。發(fā)酵過程中葡萄糖含量的降低速度能夠反映異養(yǎng)小球藻生長速度及代謝速度[20]。葡萄糖的損耗除了滅菌時的美拉德反應外，還包括發(fā)酵過程中的雜菌污染消耗、代謝途徑變化引起的損耗，這些都會造成葡萄糖對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的降低。觀察熱酸解提油廢水對發(fā)酵過程的影響除了觀察干重、pH值，還要觀察葡萄糖含量的變化。

如圖4所示，在發(fā)酵初期各實驗組的葡萄糖含量基本接近，說明提油廢水在培養(yǎng)基高溫滅菌過程中影響不大，各實驗組葡萄糖損失接近。在發(fā)酵中后期，回用比例5%、10%實驗組和對照組一樣，葡萄糖快速消耗并在發(fā)酵第5天消耗完畢，回用比例15%實驗組在第5天葡萄糖略有剩余，而其他實驗組葡萄糖均有大量殘留。葡萄糖殘留過多，不僅造成浪費，而且說明發(fā)酵過程中藻細胞活性低、發(fā)酵不徹底[21]。因此可以認為，熱酸解法提油廢水的回用影響藻細胞新陳代謝，大量廢水的回用能夠抑制葡萄糖的消耗。

圖4 不同回用比例對發(fā)酵液葡萄糖含量的影響Fig.4 Effects of different reuse ratios on glucose concentration in fermentation broth

與本實驗結(jié)果相同，在發(fā)酵液上清液回用實驗中，回用30%的上清液，發(fā)酵過程中葡萄糖含量同樣快速下降，到發(fā)酵終了葡萄糖消耗完畢。但使用相同的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵液上清液回用實驗中發(fā)酵終了干重比本實驗高，說明發(fā)酵液上清液回用提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，相同用量的葡萄糖轉(zhuǎn)化成更多的干重[22]，原因可能是上清液中含有更多能夠刺激藻細胞生長、提高藻細胞活性的物質(zhì)。

實驗表明，熱酸解法提油廢水中含有影響葡萄糖吸收利用的物質(zhì)，回用比例為60%時，葡萄糖僅消耗了17.6%，回用比例為40%、30%時，葡萄糖消耗了33.3%、52.9%，回用比例為20%、15%時，葡萄糖消耗了80.4%、96.1%，而回用比例為10%、5%時，葡萄糖被全部消耗，回用比例越高，越影響異養(yǎng)小球藻對葡萄糖的吸收利用。

綜上，提油廢水回用5%、10%、15%時對異養(yǎng)小球藻生長代謝不會造成明顯影響，回用比例為5%、10%能夠提高異養(yǎng)小球藻發(fā)酵終了生物量、生長效率。相同條件下，回用提油廢水替代較多的自來水更有利于降低異養(yǎng)小球藻培養(yǎng)成本，因此認為提油廢水回用比例10%最佳。

3 結(jié)論

異養(yǎng)小球藻熱酸解提油廢水中既含有促進小球藻生長的因子，也有抑制小球藻生長的物質(zhì)。當提油廢水回用比例小于15%時，對藻細胞生長沒有明顯的抑制作用，甚至還能提高異養(yǎng)小球藻的發(fā)酵效率。熱酸解提油廢水(約pH 1)在中和過程產(chǎn)生的大量鹽分以及提油廢水中殘留的萃取劑可能是造成小球藻生長抑制的主要因素。