李佩佩，頡向紅，王聰，李冬冬，劉軍，王麗萍，張喜康，馬露，劉敦華

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川，750021)

紅茶菌又稱胃寶，由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌組合而成，原料經(jīng)發(fā)酵，產(chǎn)生蛋白質(zhì)、維生素、微量元素和茶多酚等營養(yǎng)物質(zhì)，有降血脂和保肝等保健功能[1]。紅茶菌生長因茶類如紅茶、綠茶茶湯的不同受影響，以發(fā)酵液的pH和還原糖含量等指標(biāo)評(píng)估其生長狀況[2]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵使產(chǎn)品風(fēng)味成分更復(fù)雜，呈現(xiàn)豐富的口感[3]。但結(jié)合乳酸菌和酵母菌制備發(fā)酵飲料時(shí)，不同的發(fā)酵方式是否影響發(fā)酵飲料品質(zhì)的研究，目前還未見報(bào)道。本文以pH值和菌膜質(zhì)量為指標(biāo)來探討紅茶、綠茶兩種茶湯對(duì)紅茶菌生長情況的影響；測定紅茶菌中分離出的酵母菌的生長曲線；采用乳酸菌和酵母菌制備發(fā)酵枸杞飲料，比較2種不同發(fā)酵方式過程中枸杞飲料的主要成分和抗氧化活性的變化，進(jìn)而運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行抗氧化活性與主要成分的相關(guān)性分析，建立回歸模型[4]，旨在為枸杞發(fā)酵飲料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枸杞，市售；紅茶菌，寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院培養(yǎng)；YPD培養(yǎng)基，山東浩中化工科技有限公司；WL培養(yǎng)基，上海信裕生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，北京索萊寶科技有限公司；2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；D-酒石酸等標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜純)和硝酸鋁等分析純，銀川偉博鑫生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000HPLC色譜儀，ThermoFisher公司；6890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司； DSX-280B滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH培養(yǎng)箱，廣州航信科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

將大小顏色均一的枸杞在65 ℃浸泡30 min。打漿后加果膠酶和纖維素酶酶解，酶解液經(jīng)殺菌后冷卻，一組先接種2.5%乳酸菌(嗜熱乳桿菌∶植物乳桿菌∶鼠李乳糖桿菌質(zhì)量比為1∶2∶1，下同)，在30 ℃下發(fā)酵40 h，再接種酵母菌二次發(fā)酵；另一組同時(shí)接種2.5%乳酸菌和酵母菌在30 ℃發(fā)酵40 h。發(fā)酵好的枸杞飲料裝罐滅菌。

1.3.2 紅茶湯、綠茶湯對(duì)紅茶菌生長的影響

紅茶菌培養(yǎng)液：參考左勇等[5]的方法。

培養(yǎng)紅茶菌：

紅茶/綠茶→浸泡15 min→過濾→冷卻→接菌→發(fā)酵(紗布封住容器，30 ℃培養(yǎng))

紅茶菌菌液pH值和菌膜質(zhì)量測定：每隔2 d測紅茶和綠茶培養(yǎng)的紅茶菌的pH值和菌膜質(zhì)量，以探討2種茶湯對(duì)紅茶菌生長的影響。

1.3.3 粗分離非釀酒酵母并測定生長曲線

(1) 非釀酒酵母的粗分離

參考分離紅茶菌的文獻(xiàn)[6]和GB 4789.2-2010，符合要求的活菌接到Y(jié)PD培養(yǎng)液培養(yǎng)，初步粗分離得酵母菌。

用WL培養(yǎng)基對(duì)粗分離酵母菌復(fù)篩，根據(jù)非釀酒酵母能把賴氨酸作為氮源的特性再次篩選，能在含賴氨酸的培養(yǎng)基上生長的為非釀酒酵母[7]。

(2) 測定非釀酒酵母生長曲線

接種1.5%活化菌于YPD培養(yǎng)液，28 ℃恒溫培養(yǎng)，新鮮培養(yǎng)基作對(duì)照，每隔2 h測OD600值。

1.3.4 乳酸菌和酵母菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)枸杞飲料有機(jī)酸的測定

色譜條件[8]：HypersilC18色譜柱(250 mm×4.6 nm×5 μm)，流動(dòng)相：0.01 mol/LV(KH2PO4)∶V(甲醇)=98∶2，緩沖溶液(pH 2.8)過0.45 μm水系濾膜，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長：210 nm，柱溫為室溫。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：檸檬酸、D-酒石酸、L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相溶解至2.0 g/L。

試樣：流動(dòng)相將2 mL枸杞飲料定容至10 mL容量瓶，取2 mL經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾到進(jìn)樣瓶，避光4 ℃保存。

1.3.5 總酚和黃酮含量的測定

參考KOLEY等[9]的方法，采用比色法測定?？偡訕?biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.096 5x+0.022 9(R2=0.999 1)，黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.008x-0.002 1(R2=0.999 7)。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除率

根據(jù)BOLLING等[10]的方法作修改，甲醇稀釋枸杞飲料，甲醇配0.04 mg DPPH/mL的溶液，在517 nm測處吸光度。DPPH自由基清除率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度。

(2)ABTS自由基清除率

(2)

式中：A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度。

(3)羥自由基清除率

根據(jù)YANG等[12]的方法。羥自由基清除率按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：Ax為試樣吸光度，A0為空白對(duì)照樣品吸光度，Ax0為水替代 H2O2的本底吸光度。

(4)超氧自由基清除率

根據(jù)蘭永麗等[13]的方法作修改。取1 mL試樣和0.4 mL鄰苯三酚(25 mmol/L),反應(yīng)25 min加1 mL 8 mmol/L的HCl，在299 nm處測的吸光值，空白為蒸餾水。超氧自由基清除率按公式(4)計(jì)算：

(4)

式中：Ax為試樣吸光度，A0為空白對(duì)照樣品吸光度，Ax0為水替代鄰苯三酚的本底吸光度。

1.3.7 測定揮發(fā)性物質(zhì)

采用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。萃取條件：萃取頭插入含3 mL試樣的萃取瓶，推出100 μm PDMS萃取頭。50 ℃水浴20 min，萃取15 min。再插入進(jìn)樣器250 ℃解吸5 min。GC和MS條件：參照林曉姿等[14]的方法。定性分析用NIST 11譜庫檢索結(jié)合人工譜圖解析確定化合物；定量分析參照束文秀等[15]方法用峰面積歸一化法。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

Origin 9.0繪圖、Excel 2016統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪表、SPSS 20.0分析顯著性和相關(guān)性并作多模型曲線擬合圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅茶菌的培養(yǎng)情況

如圖1所示，培養(yǎng)紅茶菌的紅茶和綠茶中pH都趨于快速下降且變化趨勢在整個(gè)過程基本一致，說明兩種茶中有機(jī)酸的積累速度和含量基本相同。綠茶中菌膜生成量明顯大于紅茶，可能因?yàn)榫G茶沒經(jīng)過發(fā)酵，保留了茶葉的營養(yǎng)物質(zhì)如茶多酚、碳水化合物、氨基酸、維生素和脂多糖等，能促進(jìn)醋酸菌生長繁殖，利于形成菌膜[16]。綜合pH值和菌膜量2個(gè)參數(shù)，采用綠茶湯培養(yǎng)紅茶菌。

圖1 對(duì)紅茶菌發(fā)酵液菌膜生成量和發(fā)酵pH值的影響Fig.1 Effects of fermentation liquid of tea fungus on the production of membrane and fermentation pH

2.2 非釀酒酵母生長曲線的測定結(jié)果

如圖2所示，非釀酒酵母在10～18 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。區(qū)別于釀酒酵母，非釀酒酵母在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生酯酶、糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶和纖維素酶等。這些酶與特定底物結(jié)合，酶解未加工汁液中的大分子物質(zhì)(果膠、纖維素、蛋白質(zhì)、半纖維素和木質(zhì)素等)，促進(jìn)汁液的澄清，有利于發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的釋放，改善飲料的口感、風(fēng)味和香氣[17]。

圖2 酵母菌生長曲線Fig.2 Yeast growth curve

2.3 乳酸菌和酵母菌單獨(dú)發(fā)酵枸杞飲料時(shí)產(chǎn)物含量對(duì)比

與未發(fā)酵的枸杞飲料進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)乳酸菌、酵母菌發(fā)酵后飲料的有機(jī)酸、總酸含量都顯著提高，pH值降低，還原糖含量減少。對(duì)比乳酸菌和酵母菌單獨(dú)發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)檸檬酸和總酸含量在乳酸菌發(fā)酵液中明顯多于酵母菌發(fā)酵液，而酵母菌發(fā)酵后D-酒石酸和L-蘋果酸含量明顯更多?？傮w顯示乳酸菌產(chǎn)酸能力更強(qiáng)(表1、表2和圖3)。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard curve equation for organic acids

注：x表示有機(jī)酸,mg/g，y表示峰面積。

表2 枸杞飲料中乳酸菌和酵母菌發(fā)酵后產(chǎn)物含量Table 2 Content of lactic acid bacteria and yeast fermented products in Lycium barbarum beverage

注:數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。表中*代表差異顯著(P<0.05)；**代表差異極顯著(P<0.01)。下同。

圖3 乳酸菌和酵母菌發(fā)酵后有機(jī)酸的含量Fig.3 Organic acid content after fermentation of lactic acid bacteria and yeast

2.4 不同發(fā)酵方式對(duì)枸杞飲料的主要成分和抗氧化活性變化分析

2.4.1 枸杞飲料發(fā)酵過程中pH值和還原糖的變化

pH是發(fā)酵過程影響風(fēng)味的重要參數(shù)，其變化可能是發(fā)酵時(shí)有機(jī)酸濃度增加所致[18]。由圖4可知，pH值在0～84 h總體呈下降趨勢，0～36 h下降較快，36 h 后趨于平緩。這與MENEZES等[19]研究的益生菌酵母和乳酸菌組合起始培養(yǎng)物生產(chǎn)玉米飲料的pH有相似的變化趨勢。2種不同發(fā)酵方式下枸杞飲料還原糖含量都顯著性降低，但先乳酸菌發(fā)酵再酵母發(fā)酵還原糖含量下降更顯著。

1LAB,2SB-先乳酸菌發(fā)酵，再酵母發(fā)酵；LAB+SB-乳酸菌和酵母菌同時(shí)發(fā)酵圖4 發(fā)酵枸杞飲料過程中pH值和還原糖的變化Fig.4 Changes of pH and reducing sugar during fermentationof lycium barbarum juice注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，反之不顯著。下同。

2.4.2 枸杞飲料發(fā)酵過程中總酚和總黃酮的變化

酚類影響枸杞飲料的色澤和香味，在抗氧化功能中也發(fā)揮重要作用[20]。由圖5可知，2種發(fā)酵方式下枸杞飲料的總酚和總黃酮含量在0～84 h均呈升高趨勢，且先乳酸菌發(fā)酵再酵母菌發(fā)酵枸杞飲料的總酚和總黃酮含量均高于混合發(fā)酵。未發(fā)酵時(shí)，可溶性結(jié)合酚羥基與長鏈醇類結(jié)合，F(xiàn)olin-酚法不能與其反應(yīng)，故總酚含量整體偏低；而發(fā)酵后，微生物將可溶性結(jié)合酚分解成小分子酚釋放出來，故發(fā)酵后總酚含量增加[21]。發(fā)酵過程中黃酮會(huì)隨發(fā)酵周期的增加被溶解，含量顯著增加[22]。

圖5 枸杞飲料發(fā)酵過程中總酚和總黃酮的變化Fig.5 Changes of total phenols and total flavonoids during the fermentation of lycium barbarum beverage

2.4.3 不同發(fā)酵方式過程中枸杞飲料抗氧化活性變化

用4種抗氧化方法評(píng)價(jià)不同發(fā)酵方式下枸杞飲料的抗氧化活性?？偡雍涂傸S酮決定DPPH自由基清除率的變化[23]。在2種發(fā)酵方式下枸杞飲料DPPH自由基清除率變化趨勢相反，相對(duì)于混合發(fā)酵時(shí)DPPH清除率先增加后減少，先乳酸菌發(fā)酵再酵母菌發(fā)酵時(shí)始終增加；ABTS自由基清除率均有所增加，但先乳酸菌發(fā)酵再酵母菌發(fā)酵時(shí)增加更顯著，增加了26.663%；超氧自由基清除率均降低，羥自由基清除率則均顯著升高?？赡苡捎谘趸磻?yīng)不能被超氧自由基阻止，反而有助于形成羥自由基[24]。又因酚類和黃酮類物質(zhì)都有較強(qiáng)的自由基，且發(fā)酵過程生成有抗氧化性的產(chǎn)物，故枸杞發(fā)酵飲料的抗氧化活性總體顯著增高[25]。

表3 發(fā)酵枸杞飲料的抗氧化活性變化 單位：%

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 主要成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

2.5.1 Pearson相關(guān)性分析

依據(jù)2.4結(jié)果，選擇先乳酸菌發(fā)酵、再酵母菌發(fā)酵的方式制備枸杞飲料，測定其主要成分與抗氧化活性，并分析相關(guān)性。

由表4可知，總酚與DPPH自由基清除率(r=0.918，P<0.01)、ABTS自由基清除率(r=0.79，P<0.05)、羥自由基清除率(r=0.925，P<0.01)呈顯著性正相關(guān)，與超氧自由基清除率(r=-0.931，P<0.01)呈顯著性負(fù)相關(guān)?？傸S酮與DPPH自由基清除率(r=0.896，P<0.01)、羥自由基清除率(r=0.851，P<0.01)呈顯著性正相關(guān)，與超氧自由基清除率(r=-0.862，P<0.01)呈顯著性負(fù)相關(guān)。與任紅等[26]關(guān)于黃酮抗氧化性和CHAILLOU等[27]關(guān)于多酚抗氧化性的研究結(jié)論相似，本研究發(fā)現(xiàn)總黃酮、總酚對(duì)發(fā)酵枸杞飲料抗氧化活性起決定性作用，但在不同抗氧化體系中它們的影響程度不完全一致。由相關(guān)系數(shù)得枸杞飲料中不僅黃酮和多酚有抗氧化性，其他如類胡蘿卜素、活性多糖等也有抗氧化能力。這與YANG等[28]關(guān)于枸杞汁抗氧化活性還與其他成分如還原糖等有關(guān)的研究結(jié)論相似。

表4 主要成分與抗氧化活性的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果Table 4 Pearson correlation analysis of main components and antioxidant activity

注：**表示P<0.01，呈顯著性相關(guān)。下同。

2.5.2 回歸模型分析

由2.5.1的分析結(jié)果，對(duì)和抗氧化活性相關(guān)系數(shù)最大的成分進(jìn)行多模型曲線擬合，建立回歸方程，見表5和圖6-a～圖6-d。由表5可知，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、超氧自由基清除率的二次項(xiàng)曲線決定系數(shù)R2最高，建立回歸方程分別為：y=38.220-2.257x+2.355x2(y-DPPH自由基清除率)、y=-428.218+258.236x-32.166x2(y-ABTS自由基清除率)、y=195.193-60.371x+6.602x2(y-超氧自由基清除率)，x均表示總酚含量,mg/L。

羥自由基清除率的對(duì)數(shù)曲線決定系數(shù)R2最高，建立回歸方程：y=43.657+26.868lnx(x-總酚含量，mg/L;y-羥自由基清除率)。

表5 抗氧化活性試驗(yàn)的多模型擬合結(jié)果Table 5 Multi-model fitting result of antioxidant activity test

a-DPPH自由基；b-ABTS自由基；c-羥自由基；d-超氧自由基圖6 自由基清除率與總酚的曲線擬合圖Fig.6 Curve fitting of free radical scavenging rate and total phenol

2.5.3 揮發(fā)性成分的分析

發(fā)酵過程產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物影響飲料的香氣，其中揮發(fā)性物質(zhì)決定飲料的品質(zhì)[29]。由表6和圖7可知，發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)有顯著變化，先乳酸菌發(fā)酵再酵母菌發(fā)酵枸杞飲料產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，包括醇類6種、烷烴類7種、酯類8種。

如圖8所示，發(fā)酵枸杞飲料生成的主要風(fēng)味物質(zhì)是醇類、烷烴類、酯類。枸杞汁含少量醇類，發(fā)酵是產(chǎn)生醇類的主要來源，醇類均有香氣，如3-辛烯-1-醇散發(fā)藥草味，類似薰衣草的味道[30]。酯類主要由醇和酸的縮合反應(yīng)和微生物代謝產(chǎn)生，其中甲酸辛酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯產(chǎn)生果香和酒香，可增加飲料的香氣[31-32]。一些酮類化合物包括有豆香和果香的2,3-二氫香豆酮等可通過發(fā)酵、熏焙過程、脂質(zhì)降解和氧化產(chǎn)生，賦予飲料花香、果香的香氣[33]。

a-未發(fā)酵;b-LAB+SB;c-LAB,2SB圖7 揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of volatile components

3 結(jié)論

對(duì)比紅茶和綠茶中紅茶菌的菌膜質(zhì)量和pH，發(fā)現(xiàn)綠茶更有利于紅茶菌生長。從紅茶菌中分離酵母菌，接種酵母菌和乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵枸杞飲料，結(jié)果顯示，乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵枸杞飲料時(shí)檸檬酸和總酸含量較高，而酵母菌發(fā)酵枸杞飲料D-酒石酸和L-蘋果酸含量更高。

枸杞汁為原料，接種2.5%乳酸菌和酵母菌(紅茶菌中分離出的)，采用混合發(fā)酵和先乳酸發(fā)酵再酵母發(fā)酵2種不同發(fā)酵方式在30 ℃制備發(fā)酵枸杞飲料。結(jié)果顯示，2種不同發(fā)酵方式下枸杞飲料的pH、還原糖、總黃酮、總酚含量和抗氧化活性的變化趨勢基本一致。與乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵相比，先乳酸菌發(fā)酵后再酵母菌發(fā)酵枸杞飲料的總黃酮、總酚含量較高，抗氧化活性更強(qiáng)；且生成6種醇類、7種烷烴類和8種酯類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。相關(guān)性分析表明，先乳酸菌發(fā)酵后再酵母菌發(fā)酵枸杞飲料的總酚和總黃酮含量與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、羥自由基清除率均呈顯著性正相關(guān)，與超氧自由基清除率呈顯著性負(fù)相關(guān)。

表6 揮發(fā)性物質(zhì)分析 單位：%(相對(duì)含量)

續(xù)表6

種類名稱未發(fā)酵LAB+SBLAB,2SB酯類(9種)辛酸乙酯-2.2022.96癸酸乙酯-3.664.87乙酸異戊酯--1.542,2,4-三甲基-1,3-戊二醇單異丁酸酯-10.426.53十二酸乙酯-1.65-己酸乙酯--2.37甲酸辛酯--1.52乙酸2-苯乙酯--1.26十三烷酸乙酯--6.99

注：“-”表示未檢出物質(zhì)。

a-相對(duì)含量;b-種類圖8 揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對(duì)含量Fig.8 Types and relative content of volatile substances