何頌捷，左勇，張?chǎng)?，孫時(shí)光，秦世蓉，楊建飛，徐佳，黃雪芹

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都，610101)

四川省是白酒生產(chǎn)大省，2018年產(chǎn)值近2 000億元，超過(guò)四川GDP的5%，在生產(chǎn)白酒的同時(shí)，每年產(chǎn)生的酒糟近2 100萬(wàn)t[1]。由于酒糟量大而集中，如不及時(shí)處理，會(huì)腐敗變質(zhì)，不僅浪費(fèi)資源，還會(huì)污染環(huán)境[2-3]。

在酒糟生物質(zhì)中，主要是纖維素和木質(zhì)素，此外還含有豐富的氮、磷、鉀、蛋白質(zhì)、微量元素和有機(jī)質(zhì)等[4]。目前，酒糟的用途主要是兩個(gè)方面，一是用作飼料，再就是用作燃料[5]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，將酒糟作為有機(jī)肥的原料，生產(chǎn)的生物有機(jī)肥中含氮量、含磷量、有機(jī)質(zhì)含量分別可達(dá)3%、1%、70%[2]。酒糟尤其是濃香型白酒丟糟中含有大量的粗纖維，由于腐熟發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，腐熟度不夠，容易造成制備的有機(jī)肥在施用后出現(xiàn)二次發(fā)酵，使作物出現(xiàn)燒根的現(xiàn)象?；趹?yīng)用酒糟制備有機(jī)肥存在上述問(wèn)題，在利用酒糟制備有機(jī)肥的過(guò)程中，需通過(guò)添加纖維素酶制劑，提高腐熟發(fā)酵時(shí)纖維素酶活力，以便能更高效、快速地降解酒糟中的纖維素[6]，釋放出酒糟中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-8]。其目的不但有利于腐熟發(fā)酵，提高酒糟中有機(jī)質(zhì)的利用率和酒糟生物有機(jī)肥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9]，而且在降低纖維素含量、增加蛋白質(zhì)含量的同時(shí)，還能增加土壤微生物種群數(shù)量和酶活，有利于改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，提高微生物多樣性[10]。

本研究以窖泥和酒醅為研究對(duì)象，通過(guò)不同培養(yǎng)條件，富集培養(yǎng)樣品中的微生物，在CMC-Na和酒糟浸出液培養(yǎng)基上分離純化[11]，采用DNS法對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行纖維素酶活測(cè)定，篩選出高性能降解酒糟的菌株，為酒糟高效、安全腐熟發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

酒醅和窖泥由宜賓某白酒企業(yè)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基、CMC-Na篩選培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基(將酒糟干燥后磨成粉末狀，作為唯一碳源添加到培養(yǎng)基，其余成分和篩選培養(yǎng)基相同)、發(fā)酵培養(yǎng)基等[12]由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 高效分解酒糟菌種的分離純化

富集培養(yǎng)：分別稱取酒醅和窖泥5 g，加入45 mL無(wú)菌生理鹽水，分別在28、37 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)1 h，取10 mL富集液加入到90 mL液體富集培養(yǎng)基中，分別在28、37 ℃，150 r/min下，富集培養(yǎng)24 h。將富集培養(yǎng)液梯度稀釋，吸取合適稀釋濃度的菌液于篩選培養(yǎng)基上，涂布均勻，分別在28、37 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。從篩選培養(yǎng)基上挑選具有明顯菌落差異的單菌落接種到選擇培養(yǎng)基上，分別在28、37 ℃下進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到純的單菌落。

1.3 高效分解酒糟菌種篩選

將純化得到的單菌落轉(zhuǎn)接到酒糟培養(yǎng)基，分別在28、37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑選長(zhǎng)勢(shì)好的單菌落點(diǎn)接到選擇培養(yǎng)基，分別在28、37 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h。

1.4 剛果紅篩選

1.4.1 染色剛果紅溶液

將100 mg剛果紅溶解于100 mL水中，配制為1 g/L的染色剛果紅溶液；將100 mg NaCl溶于100 mL水中為1 g/L NaCl溶液，作為脫色液。選取生長(zhǎng)旺盛、菌落形態(tài)差異明顯的單菌落，倒入適量剛果紅溶液染色8～10 min，倒去剛果紅溶液，加入NaCl溶液脫色12～15 min，選取D/d值大的進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 剛果紅培養(yǎng)基復(fù)篩

將染色水解圈大的菌株接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在28、37 ℃,150 r/min下培養(yǎng)24 h。CMC-Na剛果紅雙層培養(yǎng)基(上層剛果紅培養(yǎng)基[1]，瓊脂：15 g/L、下層CMC-Na篩選培養(yǎng)基，瓊脂：7.5 g/L)，在上層培養(yǎng)基上均勻打3個(gè)孔，每個(gè)孔加入60 μL菌液，分別在28和37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄水解圈和菌圈比值(D/d)。

1.5 纖維素酶活測(cè)定

用DNS法測(cè)定CMC酶活[12]，分別在28、37 ℃，150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h，吸取2 mL菌液，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即為粗酶液。取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL 1% CMC緩沖液，50 ℃水浴30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷卻后定容至10 mL。對(duì)照組加0.5 mL滅活的酶液代替粗酶液，其他條件不變，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。(CMC酶活單位定義：將每分鐘由羧甲基纖維素鈉水解成1.0 μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U，即IU/mL)。

1.6 濾紙崩解實(shí)驗(yàn)[13]

取10 mL發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液于三角瓶中，每個(gè)三角瓶放入2條1 cm×5 cm的濾紙條，分別在28、37 ℃，150 r/min下培養(yǎng)，與空白組對(duì)照，觀察濾紙崩解情況。

1.7 菌株酒糟降解

取50 g烘干恒重的酒糟，按5%的接種量加入活化好的菌液，置于室溫下，每3 d測(cè)量剩余酒糟的干重，計(jì)算酒糟的降解率。

1.8 菌株鑒定

1.8.1 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察菌落形態(tài)特征，進(jìn)行革蘭氏染色[14]，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察微生物形態(tài)。

1.8.2 生理生化鑒定

參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行V-P實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生和產(chǎn)吲哚實(shí)驗(yàn)等細(xì)菌學(xué)特性實(shí)驗(yàn)。

1.8.3 分子鑒定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取菌株DNA[15]，進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，獲得的測(cè)序結(jié)果用NCBI Blast數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析相似度。

1.9 不同發(fā)酵條件對(duì)酶活的影響

分別以不同物質(zhì)為唯一碳源和氮源[16]，在不同碳源實(shí)驗(yàn)中，將篩選培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉用不同碳源代替其余成分不變；在不同氮源實(shí)驗(yàn)中，篩選培養(yǎng)基中的(NO4)2SO4用不同氮源代替其余成分不變?？刂撇煌囵B(yǎng)溫度和不同初始pH培養(yǎng)48 h、培養(yǎng)不同時(shí)間，采用DNS法測(cè)定CMC酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解纖維素菌株的分離篩選

由于細(xì)菌和嗜溫菌的最適溫度在28、37 ℃左右，在酒糟發(fā)酵腐熟過(guò)程中，中溫階段溫度控制為25～40 ℃，分解纖維素的微生物群落最活躍[17]。本實(shí)驗(yàn)分別在28、37 ℃條件下，從酒醅和窖泥中分離、篩選、純化得到9株產(chǎn)纖維素酶菌株，其菌落形態(tài)特征如表1所示。

表1 菌株菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of strains

注：N、P為以窖泥和酒醅為樣品在28℃篩出的菌株，N′、P′是在37℃篩出的菌株。下同。

初篩第2天培養(yǎng)基上開(kāi)始形成單菌落，生長(zhǎng)2 d后能觀察到明顯的單菌落，說(shuō)明菌株能產(chǎn)纖維素酶分解利用羧甲基纖維素鈉。觀察菌落的形態(tài)特征，菌株P(guān)4、P7、P9、P10和P11的單菌落形態(tài)特征基本相同。菌落表面粗糙、不規(guī)則、有褶皺，邊緣與中央顏色為污白色，有臭味；菌株N4、N′1和P′16的菌落形態(tài)大體相同，表面光滑、濕潤(rùn)、黏稠、不透明，為微黃色，有較淡的臭味；菌株N′14和N′15的菌落呈乳白色，表面光滑、黏稠、無(wú)臭味。初步判斷9株菌為細(xì)菌。

2.2 剛果紅水解圈

由于剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后剛果紅—纖維素復(fù)合物無(wú)法形成，培養(yǎng)基中會(huì)形成以菌落為中心的水解圈。以形成的水解圈大小初步篩選菌株分解纖維素的能力。將初篩得到的菌株進(jìn)行剛果紅染色，并用剛果紅培養(yǎng)基復(fù)篩，初篩得到的9株菌都能產(chǎn)生水解圈，水解圈直徑與菌落直徑比(D/d)如表2所示。

表2 剛果紅水解圈Table 2 Congo red hydrolysis cycle

由表2可知，菌株P(guān)7和P′16形成水解圈明顯大于其他菌株，D/d值分別達(dá)到了23和20，說(shuō)明菌株P(guān)7和P′16降解纖維素能力較強(qiáng)，能將培養(yǎng)基中纖維素分解成糖，剛果紅不能與之成色；菌株P(guān)5雖然水解圈直徑有17 mm，但自身菌落直也徑較大，其D/d值只有8.5，不能直接說(shuō)明P5菌株有較強(qiáng)的降解纖維素能力。

2.3 CMC酶活

按照IUPCA推薦的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，用DNS法測(cè)定纖維素酶活。查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含糖量(圖1)，根據(jù)酶活計(jì)算公式H=D·V1·C/T·V2計(jì)算菌株纖維素酶活[19]，纖維素酶活以U即IU/mL表示，采用DNS法測(cè)定菌株的CMC酶活測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

圖2 CMC酶活Fig.2 CMC enzyme activity

由圖2可知，在室溫下菌株之間CMC酶活差距較大，僅有4株菌酶活超過(guò)20 U，酶活超過(guò)30 U的僅有P7和P′16兩株菌。相比于其他菌株，菌株P(guān)7和P′16酶活較高，分別為49.31 和31.81 U。雖然部分菌株經(jīng)剛果紅染色中有較大透明圈，但在酶活測(cè)定中并未表現(xiàn)出較強(qiáng)的酶活，說(shuō)明剛果紅染色水解圈大的不一定酶活就高。

2.4 濾紙條崩解

濾紙條中含有大量的纖維素，菌株降解濾紙條的快慢能較直接地表現(xiàn)出菌株降解纖維素的能力。通過(guò)在濾紙條中加入菌液，觀察濾紙條崩解情況，根據(jù)降解所需時(shí)間，篩選降解纖維素能力強(qiáng)的菌株，結(jié)如見(jiàn)圖3所示。

圖3 濾紙條崩解所用時(shí)間Fig.3 Time taken for the filter paper to disintegrate

在反應(yīng)開(kāi)始前2 d濾紙條降解不明顯，仍然呈完整條狀，到第3天濾紙條開(kāi)始慢慢崩解，成絮狀堆積。由圖3可知，濾紙條在4 d和5 d后被菌株P(guān)7和P′16完全崩解，所用時(shí)間短于其他7株菌。其他菌株降解相同濾紙條所用時(shí)間更長(zhǎng)，降解纖維素能力弱于上述兩株菌。

2.5 酒糟降解實(shí)驗(yàn)

將酒糟作為底物培養(yǎng)微生物，并測(cè)量酒糟的降解率能最直接地表現(xiàn)出微生物降解酒糟中纖維素的能力。將菌液按5%的接種量加入到酒糟，每3 d測(cè)量酒糟的降解率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 各菌株對(duì)酒糟的降解作用Fig.4 Degradation of distiller's grains by various strains

由圖4可知，發(fā)酵前15 d加入菌株P(guān)7、P11、N′15和P′16的酒糟降解速率較快，酒糟由土黃色逐漸變?yōu)楹谏?，在發(fā)酵15 d后降解速率下降，酒糟顏色不再變化，24 d后降解率保持穩(wěn)定，反應(yīng)停止后酒糟中部分纖維素和其他物質(zhì)被分解，呈黑色。雖然N′15前9 d的降解速率較快，但在18 d后酒糟基本不再降解，最終降解率僅有9.27%，低于菌株P(guān)7和P′16。9株菌對(duì)酒糟的降解率相差較大，有4株菌的降解率未達(dá)到10%，僅有菌株P(guān)7的降解率達(dá)到了22.1%，菌株P(guān)′16降解率為18.4%。說(shuō)明菌株P(guān)7和P′16降解酒糟中纖維素的能力較強(qiáng)。

2.6 發(fā)酵條件對(duì)酶活的影響

將篩選出的9株菌株與里氏木霉分別在不同的發(fā)酵條件下進(jìn)行培養(yǎng)，采用DNS法測(cè)菌株CMC酶活，對(duì)比分析。

2.6.1 不同碳源對(duì)酶活的影響

以羧甲基纖維素鈉、無(wú)水葡萄糖、酒糟、蔗糖和糖蜜為唯一碳源，分別在28、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，用DNS法測(cè)定CMC酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同碳源對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on enzyme activity

在培養(yǎng)過(guò)程中，菌株P(guān)7和P′16長(zhǎng)勢(shì)較好，快于其他菌株形成明顯的單菌落。由圖5可知，菌株P(guān)7在不同碳源中的酶活均高于其他菌株，分別為49.31、38.46、42.83和44.61 U。蔗糖和糖蜜成分較復(fù)雜不利于微生物直接利用，導(dǎo)致菌株在蔗糖和糖蜜為碳源時(shí)酶活表現(xiàn)不夠好。由于酒糟呈酸性對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較大，形成的單菌落形態(tài)略小，因此在酒糟中各菌株的酶活都明顯降低。結(jié)果表明，以酒糟為碳源時(shí)，菌株P(guān)7的酶活高于里氏木霉，為38.46 U，說(shuō)明菌株P(guān)7適用于降解酒糟中的纖維素；菌株P(guān)′16在各個(gè)碳源下的酶活變化不大，說(shuō)明其對(duì)不同碳源的利用都較好，在不同方面應(yīng)用都適用。

2.6.2 不同氮源對(duì)酶活的影響

以酒糟粉、酵母浸粉、(NH4)2SO4、牛肉膏和蛋白胨為唯一氮源，分別在28和37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，用DNS法測(cè)定CMC酶活，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同氮源對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on enzyme activities

由圖6可知，以(NH4)2SO4為氮源時(shí)，其銨態(tài)氮能被微生物快速吸收，9株菌的長(zhǎng)勢(shì)最好，酶活高于其他氮源，其中菌株P(guān)7酶活最高，為49.31 U，因此在培養(yǎng)時(shí)(NH4)2SO4適合作為氮源。以酒糟粉作為氮源培養(yǎng)時(shí)，由于其較強(qiáng)的酸性，影響各菌種的繁殖代謝，因此各菌株的酶活都不高，僅有菌株P(guān)7的酶活有38.46 U，表明菌株P(guān)7降解酒糟中纖維素的高效性。結(jié)合圖5和圖6，菌株P(guān)′16在以酒糟浸出液為唯一碳源培養(yǎng)的酶活高于以酒糟浸出液為唯一氮源培養(yǎng)的酶活，說(shuō)明在培養(yǎng)菌株P(guān)′16時(shí)酒糟更適合作為碳源。

2.6.3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

結(jié)合酒糟堆肥腐熟時(shí)纖維素降解菌的作用時(shí)期和細(xì)菌生長(zhǎng)的所適溫度，為篩選出適合應(yīng)用于堆肥不同階段的菌株，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置28、32、36、40和44 ℃培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，用DNS法測(cè)定CMC酶活，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同溫度對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of different temperatures on enzyme activity

由圖7可知，溫度在28～36℃時(shí)，除菌株N′14和P′16外其他菌株長(zhǎng)勢(shì)較好，生長(zhǎng)速度較快，酶活達(dá)到最大值，符合細(xì)菌的最適溫度范圍。培養(yǎng)溫度在32 ℃時(shí)，菌株P(guān)7酶活接近于對(duì)照菌里氏木霉酶活，為51.12 U。說(shuō)明菌株P(guān)7和里氏木霉適用在酒糟發(fā)酵腐熟的中溫階段。由于高溫對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響較大，因此隨著培養(yǎng)溫度的變化菌株的酶活也在變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度升高，7株菌的酶活降低，培養(yǎng)溫度超過(guò)44 ℃后，僅有菌株P(guān)′16的酶活有26.53 U，高于其余菌株，說(shuō)明菌株P(guān)′16適用在堆肥腐熟的中高溫階段。

2.6.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

采用DNS法，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)48、72、96、120和144 h時(shí)菌株的CMC酶活，篩選最短時(shí)間達(dá)到高酶活的菌株，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.8 Effect of different culture time on enzyme activity

在培養(yǎng)24 h，發(fā)酵培養(yǎng)基中未長(zhǎng)出較明顯的微生物；培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵培養(yǎng)基開(kāi)始渾濁有明顯的微生物，因此培養(yǎng)48 h后開(kāi)始測(cè)定酶活。由圖8可知，在48 h時(shí)，研究對(duì)象上述9株菌的酶活達(dá)到最高，其中菌株P(guān)7酶活最高，為49.31 U；對(duì)照菌里氏木霉在培養(yǎng)48～72 h時(shí)，酶活才達(dá)到最大值，時(shí)間長(zhǎng)于篩選出的菌株，篩選出的菌株快于里氏木霉達(dá)到最大酶活。培養(yǎng)超過(guò)48 h后，培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁沉淀，由于菌種開(kāi)始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，因此酶活降低，說(shuō)明最適培養(yǎng)時(shí)間在48 h左右。

2.6.5 不同初始pH對(duì)酶活的影響

酒糟pH值在4.0左右，呈較強(qiáng)的酸性，為篩選高耐酸性的產(chǎn)纖維素酶菌株，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置初始pH 7.0、6.0、5.0、4.0和3.0，分別菌株對(duì)應(yīng)的溫度28、37 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h，用DNS法測(cè)定CMC酶活，結(jié)果如圖9所示。

圖9 不同初始pH對(duì)酶活的影響Fig.9 Effect of different initial pH on enzyme activity

實(shí)驗(yàn)中初始pH越低培養(yǎng)基上的單菌落越小，由圖9可知，初始pH 5.0時(shí)，菌株P(guān)7的酶活高于里氏木霉，為38.46 U；初始pH 4.0時(shí)，菌株P(guān)7和P′16的酶活高于里氏木霉，分別為28.46、24.55 U。由于酸性環(huán)境對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝有抑制作用，隨著pH下降菌株的長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，因此菌株酶活隨之下降。當(dāng)初始pH低于3.0時(shí)，在強(qiáng)酸環(huán)境下菌株基本失活，酶活幾乎為0。實(shí)驗(yàn)表明菌株P(guān)7和P′16耐酸性較強(qiáng)，適合投用到酒糟發(fā)酵腐熟中。

通過(guò)不同發(fā)酵條件對(duì)酶活影響的研究，以酒糟為氮源和碳源時(shí)菌株P(guān)7的CMC酶活為38.46 U；菌株P(guān)7和P′16培養(yǎng)時(shí)間較短，在培養(yǎng)48 h左右既能達(dá)到最高酶活49.31和31.81 U；在溫度32 ℃下，菌株P(guān)7酶活為51.12 U，較適合用在中溫階段；在溫度40 ℃下，菌株P(guān)′16酶活為31.81 U，適合用于中高溫階段；菌株P(guān)7和P′16耐酸性較好，初始pH 4.0時(shí)酶活為28.46和24.55 U。綜上所述菌株P(guān)7和P′16適合投用到酒糟的腐熟發(fā)酵。

2.7 菌株的鑒定

2.7.1 革蘭氏染色結(jié)果

將分離純化得到的9株降解酒糟中纖維素的菌株，進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，結(jié)果如表3所示。

革蘭氏染色制片過(guò)程要注意控制每個(gè)步驟的時(shí)間，染色后能明顯觀察到顏色變化，由表3可知，菌株P(guān)4、P7、P9、P10、P11、N′14、N′15和P′16細(xì)胞壁較薄，乙醇脫色后呈紅色，為革蘭氏陰性菌；經(jīng)染色P9和N′14呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌。染色后，在染色部分滴一滴香柏油在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，菌株P(guān)7與芽孢桿菌形態(tài)相似呈桿狀，初步判斷為芽孢桿菌。

2.7.2 生理生化鑒定結(jié)果

將得到菌株P(guān)7和P′16進(jìn)行生理生化鑒定，然后根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的表述初步判斷菌株P(guān)7和P′16的分類地位。生理生化鑒定結(jié)果如表4所示。

表3 革蘭氏染色結(jié)果Table 3 Gram stain results

表4 理化鑒定結(jié)果Table 4 Physical and chemical identification results

注：“+”表示有該特征或能利用該物質(zhì)，“-”表示無(wú)該特征或不可利用該物質(zhì)。

對(duì)菌株P(guān)7和P′16進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)結(jié)果表6與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可以得到兩菌株各項(xiàng)理化指標(biāo)與芽孢桿菌屬相似，初步認(rèn)為2株菌為芽孢桿菌屬。

2.7.3 16S rDNA相似性比較

將得到的菌株P(guān)7和P′16的16S rDNA序列在NCBI Blast中進(jìn)行對(duì)比分析[20]，用MEGA7.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建菌株P(guān)7和P′16基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖10、圖11。

圖10 P7菌株16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.10 16S rDNA phylogenetic tree of P7 strain

圖11 P′16菌株16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.11 16S rDNA phylogenetic tree of P′16 strain

由圖10和圖11可知，通過(guò)對(duì)比并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定P7菌與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)16S rDNA序列相似度達(dá)到100%；P′16菌與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)16S rDNA序列相似度達(dá)到100%。因此，菌株P(guān)7初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌；P′16初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

3 結(jié)論

酒糟在堆肥發(fā)酵是產(chǎn)生較高溫度，對(duì)多數(shù)微生物降解纖維素能力有不利影響。本研究在28 ℃條件下從酒醅和窖泥中篩選出5株具有降解酒糟能力的菌株，在37 ℃條件下篩選出4株具有降解酒糟能力的菌株。用這9株菌與對(duì)照菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的研究，得到2株適合用于酒糟發(fā)酵腐熟的菌株—P7和P′16。對(duì)P7和P′16進(jìn)行的研究表明，該菌在酒糟中酶活高、對(duì)酸性環(huán)境和溫度耐受性好，在酒糟中酶活分別為38.56和38.55 U，且降解酒糟中纖維素能力強(qiáng)，對(duì)酒糟的降解率分別為22.1%和18.1%。經(jīng)過(guò)16S rNDA相似性對(duì)比結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)，初步確定菌株P(guān)7為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)；P′16為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

在酒糟中加入產(chǎn)纖維素酶的菌株可高效、快速的降解酒糟中的粗纖維，釋放出酒糟的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于發(fā)酵，提高酒糟中有機(jī)質(zhì)的利用率，改善酒糟生物有機(jī)肥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在今后的研究中可以對(duì)P7和P′16和其他微生物之間的協(xié)同作用，進(jìn)一步構(gòu)建高效、安全降解酒糟的復(fù)合菌劑。