陳貴元，劉林波，桑鵬，楊力權(quán)*

1(大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理,671000)2(云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理,671000)3(大理大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理,671003)

脂肪酶(lipase，E.C3.1.1.3) 全稱為酰基甘油水解酶(triacylglycerol acylhydrolases)，是一類既可水解長鏈脂肪酸甘油酯生成甘油和長鏈脂肪酸又可逆向合成的酶類[1]。脂肪酶還是一類具有多種催化功能的酶，能在油-水界面上(異相系統(tǒng))催化甘油三酯及不溶于水的酯類進(jìn)行水解和醇解反應(yīng)，或是在有機(jī)體系(有機(jī)相系統(tǒng))中進(jìn)行酶促合成和酯交換反應(yīng)[2]。脂肪酶廣泛分布于動物、植物和微生物體內(nèi)，其中以微生物類脂肪酶居多。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)脂肪酶的微生物有熒光假單胞菌、黑曲霉菌、根霉菌、毛霉圓柱假絲酵母菌、圓弧青霉黏質(zhì)色桿菌和枯草桿菌[3]。脂肪酶可以催化脂水解、醋交換、醋合成等反應(yīng)，因而在食品、化妝品、皮革、生物柴油等領(lǐng)域均具有廣泛應(yīng)用。

嗜熱脂肪酶和普通脂肪酶相比具有耐高溫的特點(diǎn)。嗜熱脂肪酶主要分離自一些特殊環(huán)境中的微生物，例如熱泉、深海熱液、廢水處理廠等特殊環(huán)境微生物。在商業(yè)上也因?yàn)槠湓诟邷叵戮哂休^高的反應(yīng)效率，可以減少微生物污染的可能性，降低反應(yīng)溶液的黏度，提高底物的溶解度等特點(diǎn)，受到越來越多的重視，并且已經(jīng)有很多嗜熱脂肪酶已經(jīng)被純化、克隆和進(jìn)行性質(zhì)的研究，并且被運(yùn)用于洗滌劑和生活污水等方面[4]。

由于高溫脂肪酶具有重要的作用及價值，篩選產(chǎn)高溫脂肪酶的菌株成了一項(xiàng)重要的工作。本實(shí)驗(yàn)以彌渡熱泉土樣為材料，篩選出產(chǎn)高溫脂肪酶的菌株，并對其分類鑒定及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為脂肪酶的發(fā)酵工業(yè)新備選菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源，為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步獲得產(chǎn)脂肪酶基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品來自大理彌渡縣石夾泉熱泉的底泥，熱泉水溫55℃。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CX31型顯微鏡，奧林巴斯；754型紫外可見光分光光度計，上海菁華儀器公司；DL-8000C高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司；BPH-9052型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；THZ-82型水浴恒溫?fù)u床，常州國華電器有限公司；YXQ-LS-50II型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；JJ-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ABI2720型PCR擴(kuò)增儀，美國ABI；DYCP-31DN型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.1.3 試劑

酵母抽提物、蛋白胨，英國進(jìn)口；瓊脂粉，西班牙進(jìn)口分裝；三丁酸甘油酯、NaCl、結(jié)晶紫、碘、乙醇、孔雀綠、番紅，國產(chǎn)分析純試劑。DNA抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、膠回收試劑盒和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基[5-6]

富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1；自然pH值。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，三丁酸甘油酯2，瓊脂粉20；自然pH值。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10； pH值7.0。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨20，K2HPO41，(NH4)2SO41，MgSO40.5，橄欖油10，自然pH值。上述培養(yǎng)基均在121 ℃，0.1 MPa下滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株富集

稱取石夾泉熱泉底泥2 g于45 mL的無菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩15 min。在無菌條件下，用移液槍吸取5 mL懸液于50 mL的富集培養(yǎng)基中，將接種好的富集培養(yǎng)基置于43 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩

將富集好的菌液稀釋至10-3、10-6、10-9倍，用移液槍分別吸取稀釋的菌液150 μL接種在篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。于37 ℃，倒置培養(yǎng)24 h。觀察菌落周圍若有透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能產(chǎn)生脂肪酶。

1.2.3 菌株復(fù)篩

將初篩得到的菌株取少量接種于種子瓶(LB液體培養(yǎng)基)，55 ℃，培養(yǎng)24 h后，將種子液按2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，55 ℃，150 r/min水浴搖床培養(yǎng)1周。離心取上清測酶活。

酶活測定：參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。配制對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)底物溶液(10mmol/L)和對硝基苯酚(p-NP)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mmol/L)：將p-NP標(biāo)準(zhǔn)溶液用1 mol/L的Na2CO3溶液稀釋成10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μmol/L 10個梯度，分別取1 mL，再分別加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL和0.5 mol/L的NaOH 3 mL，混勻后410 nm處測定吸光度，繪制對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取20 μLp-NPP底物溶液，加入780 μL Tris-HCl緩沖液，37 ℃預(yù)熱5 min后加入200 μL酶液，反應(yīng)10 min后加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL，混勻后放置5 min終止反應(yīng)，再加入0.5 mol/L的NaOH 3 mL調(diào)pH值，(將200 μL蒸餾水替換200 μL酶液，其他條件不變，即得空白)，于410 nm處測定吸光度。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出生成的p-NP濃度，進(jìn)而計算出酶活力。在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

(1)

式中：X為脂肪酶活力，U/mL；c為對硝基苯酚濃度，μmol/L；V為酸堿調(diào)節(jié)后的反應(yīng)液終體積，mL；V′為酶液的用量，mL；t為作用時間，min。

1.2.4 菌株鑒定

(1) 形態(tài)學(xué)、生理生化特征

產(chǎn)酶菌株的形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

(2) 16S rRNA基因序列測序和分析

根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進(jìn)行DNA的提取。使用通用引物 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火50 ℃，45 s，延伸72 ℃，100 s，最后延伸72 ℃，5 min，循環(huán)30次，將PCR產(chǎn)物加入預(yù)先制備好的0.8%的瓊脂糖凝膠中，140 V，電泳1 h，瓊脂糖凝膠回收根據(jù)北天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。將PCR回收產(chǎn)物送廣州英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，將獲得的序列提交GenBank (http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov)，根據(jù)BLAST數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.5 菌株最適生長溫度

按接種量為1%的菌種于LB液體培養(yǎng)基中，置于不同的溫度(25、31、37、43、49、55 ℃)下?lián)u床培養(yǎng)24 h，然后在波長600 nm處測定各個溫度下菌株生長的吸光值，以確定菌株的最適生長溫度。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

(1)溫度對酶活的影響

將酶液分別在4～75 ℃條件下測定脂肪酶的活力。

(2)pH值對酶活力的影響

在最適酶活溫度下，配制不同pH值的反應(yīng)緩沖液，檢測不同的pH值對脂肪酶活力的影響。

(3)酶的熱穩(wěn)定性

將1 mL酶液分別置于不同的溫度(4、25、37、55、75 ℃)下保溫，在保溫15、30、60、90、120 min時測定酶活。以保溫0 min溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比，并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線。

(4)金屬離子對酶活力的影響

將1 mL的酶液和10 μL濃度為0.1 mol/L的金屬離子(Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+)混勻，將其放置到4 ℃冰箱過夜，第2天測定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定和觀察金屬離子對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值的大小。篩選出3株產(chǎn)高溫脂肪酶菌株. 其中1號菌株水解圈直徑與菌落直徑比值(R1 /R2)最大。經(jīng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)3株菌均為分泌型脂肪酶產(chǎn)生菌，且1號菌株酶活最高，達(dá)到46.11 U/mL，與初篩的結(jié)果相符。因此，選擇1號菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究菌株，命名為Lip-55，其產(chǎn)生的水解圈如圖1所示。

圖1 Lip-55菌落產(chǎn)生的水解圈Fig.1 The hydrolysate circle produced by Lip-55 colony

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征

Lip-55在LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)72 h后，菌落呈淡黃色，不透明，圓形隆起，黏稠，不易挑取。革蘭氏染色為陽性，菌體呈球桿狀(圖2)，無芽孢。

圖2 Lip-55的革蘭氏染色(100×)Fig.2 The gram staining of Lip-55

對Lip-55的生理生化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)V-P實(shí)驗(yàn)為弱陽性；甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性；葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為能利用糖，但不產(chǎn)氣。

2.2.2 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA基因測序，所獲得的序列長度為1 439bp，將Lip-55的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)Lip-55與不動桿菌屬的16S rRNA基因序列自然聚類，Lip-55的16S rRNA基因序列與15條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，從圖中可以看出Lip-55與Acinetobactersp. strain W1(KX622562.1)的菌株聚為一群，相似性也最高，為99.82%，表明Lip-55與Acinetobactersp.的親緣關(guān)系最近。

圖3 基于16S rRNA基因序列相似性的菌株Lip-55與15株細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The Phylogenetic tree of Lip-55 and other 15 strains based on 16S rRNA

根據(jù)Lip-55的形態(tài)學(xué)及生理生化特征觀察，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)[9]，以及Lip-55 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹，將Lip-55初步鑒定為不動桿菌屬(Acinetobactersp.)的1株菌，命名為Acinetobactersp. Lip-55。

2.3 菌種的最適生長溫度

按照實(shí)驗(yàn)方法，在波長600 nm處測定不同溫度培養(yǎng)下LB培養(yǎng)基的吸光值，以600 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)做溫度—吸光值關(guān)系曲線，結(jié)果如圖4所示。

圖4 Lip-55菌株生長曲線Fig.4 The growth curve of Lip-55 strain

由圖4可知，25～37 ℃菌體的生長量隨著溫度的升高而增加，37 ℃時，LB培養(yǎng)基在600 nm處的吸光值最高，表明37 ℃是菌株的最適生長溫度。37 ℃以后，菌體生長量隨著溫度的升高而下降，菌株在55 ℃下菌體還能生長，表明菌株屬于典型的耐高溫菌。

中國食品工業(yè)協(xié)會常務(wù)副會長劉治曾公開表示，對食品工業(yè)而言，精準(zhǔn)的政策和制度安排、有效市場機(jī)制的構(gòu)建，將最大程度地激發(fā)出食品企業(yè)的活力，加快淘汰落后產(chǎn)能，擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)產(chǎn)能，改善有效供給和中高端供給，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化升級。

2.4 菌株Lip-55的脂肪酶性質(zhì)

2.4.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)制作對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，制作出的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.003 6X+0.000 6，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.990 5，表明線性比較好，可供后續(xù)酶活測定使用。

2.4.2 溫度對酶活的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，在不同溫度下測定酶的活性，以酶活力為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)做溫度—酶活關(guān)系曲線(圖5)。

圖5 溫度對Lip-55脂肪酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of Lip-55 lipase

由圖5可知，低溫能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4 ℃的條件下，脂肪酶仍具有活性，但活性較低。4～55 ℃，隨著溫度升高，酶活力增加，在55 ℃時，酶活力達(dá)到最大值46.1 U/mL。在55 ℃之后，隨著溫度升高，脂肪酶活力反而降低。酶在其最適溫度范圍內(nèi)，活性最高、酶促反應(yīng)速率最大。超過最適酶活溫度，反應(yīng)速度反而下降[10-11]。表明該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，屬于典型的耐熱脂肪酶，脂肪酶的最適反應(yīng)溫度一般在30～50 ℃[12]，許多利用脂肪酶的工業(yè)催化過程都要求較高的反應(yīng)溫度，如紙漿脫脂脫墨、皮革脫脂、牛奶脫脂生產(chǎn)等，本研究獲得的脂肪酶最適催化溫度為55 ℃，表明該脂肪酶具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。

2.4.3 脂肪酶的最適反應(yīng)pH

由圖6可知，酶活隨著反應(yīng)液pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在pH 5.5附近達(dá)到最大值，繼續(xù)增大反應(yīng)體系pH，該脂肪酶活力反而下降，可能是堿性條件影響了酶與底物的結(jié)合，或者是堿性環(huán)境下，脂肪酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都遭到了破壞。因此該酶的最適反應(yīng)pH值為5.5，屬于酸性脂肪酶。酸性脂肪酶可作為飼用酶制劑應(yīng)用于飼料工業(yè)，還可作為藥物治療消化功能不足的疾病[13]。該酶的最適反應(yīng)pH值為5.5，表明該脂肪酶具有潛在的飼料加工及藥用價值。

圖6 pH對Lip-55脂肪酶活性的影響Fig.6 Effects of pH on the activity of Lip-55lipase

2.4.4 脂肪酶熱穩(wěn)定性

按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定其各個溫度下不同時間點(diǎn)脂肪酶的酶活，以保溫0 min溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖7所示。

圖7 Lip-55脂肪酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of Lip-55 lipase

由圖7可知，脂肪酶在25 ℃以下，Lip-55脂肪酶能夠在長時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定的酶活。表明該酶可在較低的溫度下保存，酶在75 ℃保溫120 min，相對酶活損失近90%，菌株產(chǎn)生的酶雖然是高溫脂肪酶，但酶在較高的溫度下，酶活性隨著保溫的時間延長而降低，可能是高溫使酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性較差的特性。

2.4.5 金屬離子對酶活力的影響

本實(shí)驗(yàn)中將加有金屬離子的稀釋酶液在4℃保溫過夜，以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定各種金屬離子對酶活力的影響結(jié)果，如表1所示。

表1 金屬離子對Lip-55纖維素酶活的影響Table 1 The effect of metal ions on Lip-55 Lipase activity

由表1可知，Ca2+、Zn2+和Mg2+對脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Ca2+、Zn2+和Mg2+可能與該脂肪酶的活性中心基團(tuán)相結(jié)合，抑制酶的活性中心與底物結(jié)合，使酶活性降低。K+、Mn2+、Fe2+、Cu2+均對該脂肪酶有一定的促進(jìn)作用，其中Fe2+對Lip-55脂肪酶酶活促進(jìn)作用較為明顯，因此，該脂肪酶在應(yīng)用過程中，可以根據(jù)需要在反應(yīng)體系中添加K+、Mn2+、Fe2+、Cu2+提高酶活力。

3 結(jié)論

脂肪酶是一類廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域的生物催化劑，具有重要的應(yīng)用價值。脂類水解酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，由于動植物脂肪酶作用底物的范圍窄，體外活性和產(chǎn)量都很低，所以現(xiàn)在工業(yè)上所用的脂肪酶都來源于微生物[13-17]。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對菌株進(jìn)行鑒定，最終確定該菌株在分類和進(jìn)化中的地位。在工業(yè)生產(chǎn)中，耐熱酶與常溫酶相比具有諸多優(yōu)勢：(1)工業(yè)生產(chǎn)中，能降低系統(tǒng)冷卻要求，減少能耗；(2)可通過熱處理簡化酶的提純，降低制備酶的成本；(3)使酶便于運(yùn)輸和儲藏。因此，廣泛開展細(xì)菌脂肪酶，特別是嗜熱細(xì)菌脂肪酶的研究具有重要意義。嗜熱細(xì)菌(Thermophilicbacteria)通常指能在55℃以上生長的細(xì)菌，主要分布于火山口、堆肥、溫泉和工廠廢水排放口附近。嗜熱細(xì)菌所產(chǎn)的酶往往具有極強(qiáng)的耐熱性，在工業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用價值[18]。本實(shí)驗(yàn)從大理彌渡白總旗熱泉篩選到1株能向胞外分泌高溫脂肪酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為不動桿菌，命名為Acinetobactersp.Lip-55。菌株最適生長溫度為37 ℃，菌株在55℃仍能生長。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，最適作用溫度為55℃，與沈曉莉等報道的嗜熱脂肪酶S3具有相似的酶學(xué)特性[19]，最適pH值為5.0，為酸性脂肪酶。酶在25 ℃以下能在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定，Ca2+、Zn2+和Mg2+對Lip-55脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Mn2+、K+、Fe2+、Cu2+均對Lip-55脂肪酶活力起促進(jìn)作用，其中Fe2+的促進(jìn)效果最為明顯。該脂肪酶在大多數(shù)金屬離子存在下均展現(xiàn)出較好的催化活性，表明該脂肪酶在處理含有金屬離子的制革廢水方面具有潛在的應(yīng)用價值。本研究可為脂肪酶發(fā)酵工業(yè)新型菌種資源的篩選和開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。