熊粟栗，袁文娟，高婧琪，李曉，李華志，張杰*

1(四川大學 生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都，610064)2(四川省資中縣銀山鴻展工業(yè)有限公司，四川 內(nèi)江，641200)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又被稱為嘔吐霉素、嘔吐毒素，是單端孢霉烯族化合物的一類[1]。DON具有強烈的細胞毒性與致畸性，研究表明DON與神經(jīng)障礙和免疫抑制等各種并發(fā)癥有關(guān)[2-3]，嚴重情況下可導致死亡。DON主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生[4]，廣泛出現(xiàn)于玉米、小麥、大麥等谷物及其產(chǎn)品中，可增加作物結(jié)痂的發(fā)生率，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)調(diào)查，在各種常見飼料原料中玉米受DON污染最為嚴重，檢出率達97.9%，超標率達47.7%[5]。玉米是酒精發(fā)酵工業(yè)的主要原料，目前中國已成為第三大酒精生產(chǎn)國，年產(chǎn)酒精超過900萬t[6-7]。玉米發(fā)酵制取乙醇過程中留下的副產(chǎn)物被稱為“濕態(tài)玉米酒精糟(wet distillers grains with solubles broths,WDGS)”烘干后為“干態(tài)玉米酒精糟(dar disstillers grains with solubles broths,DDGS)”[8]。DDGS融合了玉米和酵母的營養(yǎng)成分和活性因子，可直接作為動物蛋白質(zhì)飼料并且具有高蛋白，高營養(yǎng)等優(yōu)勢[9]。

DON具有熱穩(wěn)定性[10]，經(jīng)歷糖化和發(fā)酵后仍存留在玉米酒精糟中，嚴重影響后期副產(chǎn)物DDGS的品質(zhì)。這種被DON污染過的DDGS營養(yǎng)價值及口感都大大降低，并且進入食物鏈中將嚴重危害人和動物的健康，造成巨大的經(jīng)濟損失，因此有必要開發(fā)一種具有成本效益的DON去除方法。前人曾采用過多種方法對DON進行降解，包括：物理方法，如紫外線照射、微波處理；添加化學強氧化劑，如臭氧[11]和二氧化氯[12]等。但是這些方法都具有不同程度的局限，例如去除效果不穩(wěn)定，造成營養(yǎng)價值和適口性的降低。其中，最大的問題是這些技術(shù)難以與酒精發(fā)酵過程結(jié)合，不適合在酒精發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用。

電化學氧化(electrochmical oxidation，EO)是一種新興的處理技術(shù)，具有諸多的優(yōu)點，例如反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)裝置簡單、不易產(chǎn)生二次污染。因此，它被稱為環(huán)境友好型技術(shù)，已被廣泛用于降解污水中難降解的污染物，如有殘留有機氯農(nóng)藥[13]、殘留殺蟲劑[14]。但是目前利用電化學氧化技術(shù)來處理谷物中的霉菌毒素的研究還未見報道。本文采用電化學氧化法探究了電壓、時間、電解質(zhì)濃度3個因素對DON標品和WDGS中DON降解率的影響，確定了最優(yōu)降解條件，并對處理前后WDGS中總蛋白和脂質(zhì)含量進行了測定。該研究為利用電化學氧化技術(shù)去除發(fā)酵工業(yè)中難降解毒素提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WDGS，四川省資中縣銀山鴻展工業(yè)有限公司，常溫密封保存; DON標品，新加坡 Pribolab，CAS: 51481-10-8；鈦網(wǎng)(Ti mesh)電極，購自市場。其他試劑均購自成都蜀都有限公司。本實驗中除甲醇，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗裝置

實驗裝置采用“H”型電解室，將陽極室和陰極室用質(zhì)子交換膜隔開進行實驗。陰極和陽極電極材料均為鈦網(wǎng)，電極面積為23.5 cm，電極間距5 cm，各室容積15 cm3(處理玉米發(fā)酵糟液所用電解室容積為100 cm3)，磁力攪拌器以1 000 r/min進行攪拌，確保樣品完全混合。電位輸出由CHI760E電化學工作站(上海辰華)控制。

1.3 電化學處理DON標品

電壓強度及處理時間對DON降解率的影響：采用恒壓模式控制以0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V處理用電解質(zhì)溶液稀釋的5 μg/mL DON溶液，電解液為 0.2 mol/L NaCl溶液，處理時間為80 min。每10 min取200 μL樣品檢測DON含量并計算降解率。

電解質(zhì)濃度對實驗的影響：配置0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液作為電解質(zhì)溶液，在1.2 V的恒定電壓下處理60 min，每10 min取樣檢測DON濃度。

1.4 電化學處理WDGS

電壓強度對DON降解率的影響:分別采用0.8、1.0、1.2 V處理80 mL WDGS，每10 min取10 mL樣品烘干，檢測DON含量，計算降解率。

NaCl對DON降解率的影響：在1.3實驗的基礎(chǔ)上，選用0.2 mol/L NaCl為實驗電解質(zhì)濃度，比較了添加NaCl及不添加NaCl對WDGS中DON降解率的影響。

DDGS理化性質(zhì)變化：把WDGS分為添加NaCl及不添加NaCl兩組，分別用1.2 V恒電壓處理60 min并烘干，以未經(jīng)處理的DDGS作為對照。評估了不同處理后的DDGS粗蛋白、脂質(zhì)變化。粗蛋白提取采用堿提法：V(樣品)∶V(提取液)(0.1 mol/L NaOH)=1∶5，50 ℃萃取2 h，以1 000 r/min攪拌，保證樣品完全混合。8 000 r/min離心5 min，上清為粗蛋白提取物。采用考馬斯亮藍G-250法測定粗蛋白含量，并進行SDS-PAGE實驗，采用索氏提取法測定脂質(zhì)含量。

1.5 DON檢測

將1 mg DON標品溶于1 mL甲醇(LC級)，配置1 g/L儲備液，4℃避光保存。建立DON標準曲線，將DON標準儲備液用超純水稀釋為0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL的系列標準工作溶液，通過HPLC檢測。建立的標準曲線方程為y=0.018 8x-0.005 3(R2=0.999 9)，線性關(guān)系良好。

DDGS中DON提取參照國標GB/T(23503—2009)[15]及WANG等[11]的方法，將5 g樣品放入50 mL燒瓶中，加入25 mL乙腈水(體積比84∶16)。40 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后將提取物以8 000 r/min離心10 min，收集上清液。并使用固相萃取凈化柱凈化(Oasis HLB)，收集洗脫液在45℃和氮氣下干燥。最后，將干燥的殘余物用1 mL甲醇(LC級)再溶解，并通過0.22 μm有機過濾器過濾，使用HPLC進行檢測。

HPLC條件：采用Waters C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)=10∶90；柱溫：30 ℃；UV檢測波長：218 nm；流速：1.0 mL/min；檢測體積：20 μL。

1.6 統(tǒng)計學分析

每組處理平行實驗3次，獨立重復(fù)的數(shù)據(jù)進行合并后計算用標準差。使用SPSS軟件通過方差分析(ANOVA) 和Duncan檢驗(P<0.05) 分析所有數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同電壓及處理時間對DON降解率的影響

如圖1所示，不同電壓下DON降解率有較大差異，經(jīng)80 min處理后0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V電壓對應(yīng)的降解率分別為23.73%、57.02%、66.9%、79.15%、100%，當電壓達到1.4 V，處理30 min后降解率即可達到100%。由于水的電解電位為1.23 V[16]，當外加電壓高于1.23 V時，此時發(fā)生的不僅僅是電極的析氯反應(yīng)，還伴隨著強烈的水電解反應(yīng)，大量的氣泡從電極表面產(chǎn)生，更多電能用于析氧副反應(yīng)[17]。這意味著更多不必要的電力消耗，且反應(yīng)過程難以控制。1.2 V電壓處理60 min可達到76.4%的降解率，LI等[15]用臭氧處理90 min后第降解率為53.48%。說明相比傳統(tǒng)的氧化方法，電化學方法能夠更快速高效的降解DON，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

將1.2 V反應(yīng)條件下各時間點的濃度與初始濃度之比進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，擬合ln(C/C0)-t曲線，如圖2所示，在0～60 min，表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，R2=0.96。說明該電化學反應(yīng)在60 min符合一級動力學反應(yīng)。這為將來進一步探究該電化學反應(yīng)條件機理及優(yōu)化實驗方案提供了思路。由圖2可知，在不同的電壓條件下，DON降解率在前30 min內(nèi)增加迅速，在30～60 min內(nèi)增速變緩，60 min后降解率無明顯變化。因此我們選擇1.2 V，60 min作為后續(xù)實驗條件。

圖1 DON降解率Fig.1 Degradation rate of DON注：初始DON質(zhì)量濃度5 μg/mL，電解質(zhì)0.2 mol/L NaCl。圖2同。

圖2 ln(C/C0)在室溫下隨時間的變化Fig.2 Variation of ln(C/C0) with the time at room temperature

2.2 NaCl濃度對DON降解的影響

不同NaCl濃度(在0～0.5 mol/L)在1.2 V條件下處理60 min后的DON降解率如圖3所示。在0.2 mol/L NaCl電解液中，降解率為79.22%，當NaCl濃度達到0.3 mol/L時，DON的降解率降低至69.18%。之后，NaCl濃度增加但DON降解率變化無顯著性差異。在電化學氧化過程中，溶液中活性氯物質(zhì)的濃度是一個重要參數(shù)[18]。當電解液中的NaCl濃度較低時，隨著NaCl含量的增加，電極的氯析出速率相應(yīng)增加，電解液中的氯活性物質(zhì)濃度也增加，因此降解效果顯著增加。然而，當NaCl增加到一定濃度時，電解產(chǎn)生的大量氯氣無法完全溶解在水中形成氯活性物質(zhì)，一部分氯氣溢出并隨之有更多的氯氣擴散[19]，因此溶液中氯活性物質(zhì)的濃度反而降低，導致降解速率降低。綜上，我們將0.2 mol/L的NaCl溶液作為實驗電解質(zhì)濃度進行后續(xù)實驗。

圖3 電解質(zhì)NaCl濃度對DON降解的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration in electrolyte on DON degradation 注：不同字母(a～d)的均值經(jīng)Duncan檢驗后的差異性具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。下同。

2.3 鈦網(wǎng)電極重復(fù)性實驗

在使用電化學氧化技術(shù)處理DON時，電極重復(fù)使用能力與DON的降解效果和設(shè)備成本息息相關(guān)。如圖4所示為3次連續(xù)實驗鈦網(wǎng)電極對DON的降解率。第1次使用之后，不對電極進行任何處理即開始下一次實驗，第2次實驗中DON的降解效率出現(xiàn)了明顯的下降，僅為48.96%。第2次實驗之后，用甲醇對電極表面進行沖洗后再進行第3次實驗，DON降解效率又回升至75.02%，與第1次電解實驗的降解率無顯著性差異，說明經(jīng)簡單處理后鈦網(wǎng)即可具備良好的重復(fù)使用性。

圖4 循環(huán)次數(shù)對DON降解的影響Fig.4 Effect of recycling times on degradation of DON.

2.4 電壓強度及NaCl對WDGS中DON降解率的影響

圖5-A為添加0.2 mol/L NaCl時不同電壓對WDGS中DON的影響。與處理標準品溶液過程類似，WDGS中DON的降解率也隨著電壓強度的升高而升高。0.8、1.0、1.2 V下對DON的降解率分別為26.25%、40.09%、51.72%。說明WDGS復(fù)雜的溶液環(huán)境可能對電化學氧化效果產(chǎn)生不利的影響，但仍然高于李曉等[20]用ClO2處理12 h后達到40.70%的降解率，并且大大降低了處理時間。同時也提醒了我們，WDGS復(fù)雜的溶液環(huán)境具有作為電解質(zhì)的潛力，因此我們將1.2 V條件下的實驗結(jié)果與不加NaCl 1.2 V處理的WDGS中DON降解率變化進行了對比。如圖5-B所示，1.2 V處理60 min后DON去除率為43.28%，說明不添加額外的電解質(zhì)依然具有良好的降解效果，這又進一步降低了處理成本。綜上所述，雖然電化學氧化處理對WDGS中DON的降解率略低于處理標準品的降解率，但WDGS液態(tài)狀態(tài)以及成分復(fù)雜的特殊特性，使得該方法仍然可以作為一種具有巨大潛力、低成本、易操作的去除WDGS中DON的可行方法。

A-不同電壓下WDGS中DON的降解率;B-NaCl對WDGS中DON降解率的影響圖5 電化學氧化處理WDGSFig.5 Electrochemical oxidation of WDGS

2.5 DDGS理化性質(zhì)變化

由圖6-A和表1可知，與未經(jīng)處理的對照組相比電化學氧化處理后的DDGS中粗蛋白及脂質(zhì)含量無顯著性差異。圖6-B為粗蛋白SDS-PAGE圖，其中通道1為未經(jīng)處理的DDGS的粗蛋白提取物，通道2、3分別為無NaCl和添加了0.2 mol/L NaCl的WDGS的1.2 V電解產(chǎn)物烘干后的粗蛋白提取物。如圖7所示，3組蛋白質(zhì)條帶的數(shù)量一致，蛋白質(zhì)條帶的亮度無顯著差異。說明電化學處理后的DDGS粗蛋白分子量及種類無明顯變化。因此，施加電壓和NaCl的添加對DDGS中營養(yǎng)質(zhì)量含量無顯著影響。

表1 電化學氧化處理后DDGS理化性質(zhì)的改變Table 1 Changes in the physicochemical properties of EO-treated DDGS

注：數(shù)值表示為均值標準差(n= 3)，每列上標相同字母a表示無顯著差異。

1-處理前；2-處理后(無NaCl)； 3-處理后(0.2mol/L NaCl)A-不同處理后的粗蛋白及脂質(zhì)變化;B-粗蛋白SDS-PAGE圖6 電化學氧化處理后DDGS理化性質(zhì)的改變Fig.6 Changes in the physicochemical properties of EO-treated DDGS

3 結(jié)論

本文利用電化學氧化技術(shù)對DON標品及被DON污染的WDGS進行了處理，實驗結(jié)果表明,該技術(shù)能夠在短時間內(nèi)有效降解DON標品及WDGS中的DON。處理時間、電壓強度、電解質(zhì)濃度都對DON降解率有一定程度的影響。此外，電解質(zhì)的加入能夠極大地提高DON降解率，處理DON標準品的最佳NaCl濃度為0.2 mol/L，再提高電解質(zhì)濃度對實驗結(jié)果無顯著性影響。重復(fù)性實驗結(jié)果表明，在電極表面可能存在某種吸附機制，吸附溶液中的物質(zhì)從而影響電解效率，但這種影響可以很容易的通過甲醇沖洗去除。在處理WDGS過程中，由于其本身成分復(fù)雜的特點，使得WDGS本身可作為電解質(zhì)，不需要再加入額外的電解質(zhì)，大大降低了成本。電解處理后，DDGS的粗蛋白和脂質(zhì)含量無明顯變化。本研究為利用電化學氧化技術(shù)在乙醇發(fā)酵過程中去除DON提供了新思路，這可以作為在大規(guī)模生產(chǎn)中去除霉菌毒素的有效方法。