顧宏，潘賀鵬，張明，商曰玲，蔡國(guó)林*，陸健*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)4(江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司，江蘇 射陽(yáng)，224300)5(鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城，224051)

我國(guó)啤酒工業(yè)經(jīng)過(guò)二十多年的發(fā)展，目前產(chǎn)量穩(wěn)中有降的趨勢(shì)日益顯現(xiàn)[1]。相反，工坊啤酒憑借著多樣的風(fēng)格和豐富的口感特征開(kāi)始盛行起來(lái)，近幾年呈現(xiàn)了爆發(fā)式的增長(zhǎng)[2]。工坊啤酒的特殊風(fēng)味與顏色都得益于特種麥芽，借由工坊啤酒的快速發(fā)展，作為其重要原料，人們對(duì)特種麥芽的關(guān)注也越來(lái)越多[3]。結(jié)晶麥芽作為特種麥芽中的重要品種，隨著工坊啤酒的興起，它的需求量也在日益增加。

結(jié)晶麥芽，又稱焦糖麥芽，是一種獨(dú)特的麥芽類型，屬于焙烤麥芽。其制麥工藝較為特殊，需要將發(fā)芽后的綠麥芽完整地進(jìn)行預(yù)糖化，然后在高溫下焙烤完成[4-5]。優(yōu)質(zhì)的結(jié)晶麥芽，其胚乳呈現(xiàn)出穩(wěn)定的水晶、玻璃狀，這也是其名字由來(lái)的原因[6]。在結(jié)晶麥芽的制備過(guò)程中，通過(guò)預(yù)糖化，麥芽中的淀粉和蛋白分別在淀粉酶和蛋白酶的作用下，分解成麥芽糖等還原糖和氨基酸，隨后在高溫焙烤下發(fā)生美拉德反應(yīng)與焦糖化反應(yīng)[7-8]。通過(guò)美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)，有大量的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，包括了醛類、酮類、醇類和酯類等[9-11]。除此之外，還有大量的含氧、含氮的雜環(huán)化合物，使結(jié)晶麥芽擁有類似焦糖、太妃糖的風(fēng)味[12-13]。這些風(fēng)味物質(zhì)不僅賦予了結(jié)晶麥芽怡人的焦糖味、奶油香味和甜味，也在工坊啤酒的風(fēng)味與顏色上發(fā)揮重要作用[14-15]。然而，由于缺乏足夠的投入，目前國(guó)內(nèi)少量的結(jié)晶麥芽普遍存在結(jié)晶率不高，結(jié)晶品質(zhì)不佳和風(fēng)味物質(zhì)含量偏低等缺陷，導(dǎo)致出現(xiàn)優(yōu)質(zhì)結(jié)晶麥芽被國(guó)外進(jìn)口結(jié)晶麥芽所壟斷的現(xiàn)象。

本研究通過(guò)比較不同發(fā)芽時(shí)間的綠麥芽在糖化后還原糖與游離氨基氮含量，進(jìn)而確定適合用于結(jié)晶麥芽制備的綠麥芽，并采用單因素和響應(yīng)面分析優(yōu)化預(yù)糖化工藝，制備優(yōu)質(zhì)的結(jié)晶麥芽，并對(duì)其常規(guī)理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，為后續(xù)優(yōu)質(zhì)結(jié)晶麥芽的國(guó)產(chǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加麥(麥特卡夫)，由江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司提供；3,5-二硝基水楊酸，NaOH，L-酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、麥芽糖、Na2HPO4、KH2PO4、茚三酮、果糖、KIO3、乙醇、甘氨酸、可溶性淀粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5-壬酮，阿拉??；食品級(jí)乳酸，鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 制麥方法

稱取除雜后的大麥200 g，置于浸麥槽中，用水洗麥2次，每次間隔10 min。之后將水沒(méi)過(guò)大麥，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，溫度為15 ℃，濕度為95%RH。第一次浸麥時(shí)間為4 h，隨后斷水，斷水時(shí)間為12 h，之后第2次浸麥5 h，第2次斷水2 h。第2次斷水結(jié)束后為大麥的發(fā)芽階段，并開(kāi)始計(jì)算大麥的發(fā)芽時(shí)間。在發(fā)芽階段每隔24 h需補(bǔ)水20 g，最終發(fā)芽結(jié)束得到綠麥芽。

1.3 綠麥芽發(fā)芽時(shí)間的選擇

在大麥發(fā)芽第24、36、48、60、72、84和96 h時(shí)取樣50 g，加入200 mL蒸餾水，在70 ℃下糖化1 h。之后取10 g糖化好的綠麥芽，加入100 mL蒸餾水，用攪拌器粉碎，在8000 ×g下離心15 min，取上清，測(cè)定其還原糖與游離氨基氮含量。游離氨基氮采用茚三酮法進(jìn)行測(cè)定[16]，還原糖采用DNS法進(jìn)行測(cè)定[17]。

1.4 結(jié)晶麥芽制備工藝及描述

結(jié)晶麥芽與普通麥芽的制備工藝的區(qū)別在于，結(jié)晶麥芽需要經(jīng)過(guò)預(yù)糖化。模擬啤酒釀造中的糖化工藝，將得到的綠麥芽整顆投入水中，在一定的溫度與pH下，麥芽中的蛋白酶將蛋白分解成氨基酸(蛋白休止階段)，同樣，淀粉酶會(huì)將淀粉分解成麥芽糖、葡萄糖等還原糖(糖化階段)。預(yù)糖化結(jié)束后，將綠麥芽投入旋轉(zhuǎn)焙烤爐中進(jìn)行焙焦。冷卻后即可得到結(jié)晶麥芽。

1.5 蛋白休止階段的工藝優(yōu)化

將綠麥芽浸入糖化水中，用食品級(jí)乳酸調(diào)節(jié)糖化水至不同的pH(2、3、4、5、6和7)，在一定溫度下(分別為55、60、65、70、75、80 ℃)進(jìn)行蛋白質(zhì)休止(分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)。蛋白休止結(jié)束后進(jìn)行游離氨基氮含量的測(cè)定。

1.6 糖化階段的工藝優(yōu)化

蛋白休止后，用食品級(jí)乳酸調(diào)節(jié)糖化水至不同的pH(2、3、4、5、6、7)，在一定溫度下(55、60、65、70、75、80 ℃)進(jìn)行糖化(0.5、1、1.5、2、3、4 h)。糖化結(jié)束后進(jìn)行還原糖含量的測(cè)定。

1.7 基于響應(yīng)面分析的工藝優(yōu)化

利用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，并計(jì)算得到最優(yōu)解，再進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定預(yù)糖化工藝控制點(diǎn)。

1.8 結(jié)晶麥芽的麥汁制備及其理化指標(biāo)測(cè)定

結(jié)晶麥芽的麥汁制備參考美國(guó)釀造化學(xué)家協(xié)會(huì)(American Society of Brewing Chemists，ASBC)分析方法進(jìn)行[18]。麥汁中還原糖與游離氨基氮含量的測(cè)定見(jiàn)1.3中的測(cè)定方法。麥汁色度與浸出率的測(cè)定參考啤酒麥芽國(guó)標(biāo)[16]。結(jié)晶麥芽結(jié)晶率的測(cè)定為隨機(jī)選擇100顆結(jié)晶麥芽并切開(kāi)，麥芽?jī)?nèi)部結(jié)晶一半以上才算作結(jié)晶麥芽，否則不是，最終計(jì)算結(jié)晶率如公式(1)所示：

(1)

1.9 結(jié)晶麥芽浸提液揮發(fā)性成分的測(cè)定

結(jié)晶麥芽樣品10 g，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，精確稱取5.00 g麥芽細(xì)粉，加入100 mL水，46 ℃下浸提30 min，然后升溫至70 ℃浸提60 min，取7.2 mL浸提液，加入0.8 mL內(nèi)標(biāo)(0.5 mg/L的5-壬酮溶液)，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行GC-MS定量測(cè)定。

SPME提取方法：用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在具塞頂空瓶上部吸附萃取50 min，在氣相色譜進(jìn)樣口250 ℃進(jìn)行解吸，解吸1 min。

色譜條件：TG-WAXMS(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：45 ℃保持1 min，以6 ℃/min速度上升到230 ℃，保持6 min；載體為He，流速1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸時(shí)間1 min；不分流。

質(zhì)譜條件：離子源EI源；離子源溫度：200 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV，掃描質(zhì)量范圍33～400 u；進(jìn)樣方法：手動(dòng)進(jìn)樣。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值，在圖中以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)差異的顯著性(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽時(shí)間的選擇

在大麥發(fā)芽24、36、48、60、72、84和96 h時(shí)取樣，糖化，粉碎后測(cè)定還原糖和游離氨基氮的含量。由圖1可知，大麥在發(fā)芽24～84 h時(shí)，綠麥芽中的還原糖與游離氨基氮含量持續(xù)上升。但繼續(xù)發(fā)芽至96 h時(shí)，還原糖與游離氨基氮的含量開(kāi)始下降。這是由于在發(fā)芽后期，部分蛋白質(zhì)，包括淀粉酶與蛋白酶會(huì)被分解為肽與氨基酸，然后運(yùn)輸至胚中，用于長(zhǎng)成新的根芽與葉芽[19]。在發(fā)芽84 h時(shí)，還原糖與游離氨基氮含量最高，這與王芝梅報(bào)道大麥發(fā)芽第4天時(shí)，綠麥芽中的淀粉酶與蛋白酶的酶量與活性較高基本一致[20]。所以，選擇發(fā)芽84 h的綠麥芽作為制備結(jié)晶麥芽的原料，有利于在結(jié)晶麥芽制備過(guò)程中形成更多的還原糖和氨基酸，進(jìn)而提高結(jié)晶率和增加美拉德產(chǎn)物。

圖1 綠麥芽糖化后還原糖與游離氨基氮含量的變化Fig.1 Changes of reducing sugar content and free amino nitrogen content after glycosylation of green malt

2.2 蛋白休止階段的工藝優(yōu)化

用食品級(jí)乳酸調(diào)節(jié)綠麥芽預(yù)糖化水的pH至2、3、4、5、6、7，在65 ℃下進(jìn)行蛋白質(zhì)休止1.5 h。不同pH條件下，游離氨基氮的含量無(wú)明顯變化(圖2-a)，表明pH的變化對(duì)蛋白休止無(wú)明顯影響。在麥芽中，含有酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，使得其對(duì)pH敏感性變小，從而導(dǎo)致pH的變化對(duì)蛋白休止無(wú)明顯影響[21]。通過(guò)調(diào)節(jié)糖化溫度為55、60、65、70、75、80 ℃(pH自然，蛋白休止時(shí)間為1.5 h)，確定最適的蛋白質(zhì)休止溫度(圖2-b)。結(jié)果表明，在60 ℃時(shí)，綠麥芽中的蛋白酶能夠更好的將麥芽中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸，游離氨基氮含量最高，為142.14 mg/L。麥芽中主要蛋白酶的最適作用溫度為50～55 ℃，然而由于綠麥芽未經(jīng)粉碎，導(dǎo)致麥芽?jī)?nèi)部溫度可能低于糖化溫度，所以蛋白休止階段的最適溫度為60 ℃。不同蛋白休止時(shí)間對(duì)游離氨基氮含量差異明顯(圖2-c)，但在2 h后，游離氨基氮的含量增加不明顯，所以蛋白休止時(shí)間選擇2 h較為合適。

a-預(yù)糖化工藝中pH對(duì)蛋白休止效果的影響;b-預(yù)糖化工藝中溫度對(duì)蛋白休止效果的影響;c-預(yù)糖化工藝中時(shí)間對(duì)蛋白休止效果的影響圖2 預(yù)糖化工藝蛋白休止效果的影響Fig.2 Effect of pre-saccharification process on the protein resting

2.3 糖化階段的工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

同蛋白休止階段一樣，用食品級(jí)乳酸調(diào)節(jié)水的pH值至2、3、4、5、6、7，投入綠麥芽，并在60 ℃下水浴1.5 h，發(fā)現(xiàn)在pH=3時(shí)，還原糖的含量達(dá)到最高為10.34 g/L(如圖3-a)。在pH=3的條件下，分別于55、60、65、70、75、80 ℃將綠麥芽水浴1.5 h，測(cè)定還原糖含量。結(jié)果表明，70 ℃時(shí)，綠麥芽的還原糖含量最高，達(dá)到24.04 g/L(如圖3-b)。綠麥芽中同時(shí)存在α-淀粉酶與β-淀粉酶，糖化是在它們的共同作用下完成的。其中α-淀粉酶的最適pH值為4.5，且耐高溫，在93～95 ℃仍能保持足夠高的活性。β-淀粉酶的最適pH值與α-淀粉酶大體相同，但不能夠耐高溫，其最適溫度為50～55 ℃。但由于糖化時(shí)沒(méi)將綠麥芽粉碎，有麥殼的保護(hù)，導(dǎo)致麥芽?jī)?nèi)部的pH和溫度與環(huán)境存在差異，能使得當(dāng)pH=3，溫度為70 ℃時(shí)，糖化效果最好。進(jìn)一步跟蹤分析在此條件下，時(shí)間對(duì)糖化效果的影響(圖3-c)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2 h后，還原糖的含量增加不明顯，所以最終確定糖化時(shí)間為2 h。

a-預(yù)糖化工藝中pH對(duì)糖化效果的影響;b-預(yù)糖化工藝中溫度對(duì)糖化效果的影響;c-預(yù)糖化工藝中時(shí)間對(duì)糖化效果的影響圖3 預(yù)糖化工藝對(duì)糖化效果的影響Fig.3 Effect of pre-saccharification process on the saccharification

2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化糖化效果

以糖化條件中的溫度與pH為試驗(yàn)因子，還原糖的含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)2因素3水平的中心組合試驗(yàn)對(duì)糖化工藝進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。用Design-Expert V8.0.6分析可得回歸方程為：Y=-571.02+15.26×A+32.99×B+0.02×A×B-0.11×A2-5.14×B2

表1 糖化工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of response surface methodology of saccharification process

表2為回歸模型的方差分析，由表2可知，本實(shí)驗(yàn)所選擇的模型差異極顯著(模型的P=0.002 6)，說(shuō)明此回歸模型對(duì)綠麥芽糖化效果有很好的預(yù)測(cè)性。模型決定系數(shù)R2=0.894 2與模型修正決定系數(shù)R2=0.818 7較為接近，所以該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的擬合度較好。失擬誤差P=0.248 4>0.05，失擬誤差不顯著，表明除了模型研究以外的因素對(duì)糖化效果的影響較小。信噪比為9.623，大于4，說(shuō)明該模型可以用于預(yù)測(cè)。

表2 糖化工藝回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) regression model of saccharification process

因此，可以通過(guò)回歸方差代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。通過(guò)顯著性檢驗(yàn)P值的大小可以得到溫度與pH這2個(gè)因素中，pH對(duì)于糖化效果的影響較大。溫度與pH的交互作用影響不顯著，A2、B2對(duì)糖化效果的影響顯著，其中B2對(duì)糖化效果的影響極顯著。將表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面曲線分析，兩者有較好的二次拋物線關(guān)系，所以還原糖含量存在最大值。

通過(guò)Design-Expert V8.0.6對(duì)糖化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到綠麥芽糖化工藝的最佳條件為：溫度為71.1 ℃，pH為3.36。在此工藝條件下，最終還原糖含量的預(yù)測(cè)值為26.69 g/L。采用上述條件來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，得到的還原糖含量實(shí)測(cè)值為(26.2±0.15)g/L，與預(yù)測(cè)值26.69 g/L的相對(duì)誤差為1.84 %，進(jìn)而更能夠說(shuō)明此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度較好，得到的回歸方程在本實(shí)驗(yàn)中有實(shí)際意義。

2.4 結(jié)晶麥芽品質(zhì)分析

2.4.1 外觀

將結(jié)晶麥芽剖開(kāi)，里面胚乳與普通麥芽不同，呈現(xiàn)棕色或黑棕色的結(jié)晶狀(圖4)。本工藝制備的結(jié)晶麥芽，其內(nèi)部能夠完全結(jié)晶(圖4-a)，而商業(yè)市售的結(jié)晶麥芽則只有部分結(jié)晶，其余的仍呈現(xiàn)與普通麥芽相同的白色粉末狀胚乳(圖4-b)。通過(guò)工藝優(yōu)化后，結(jié)晶品質(zhì)改善明顯。

a-本工藝制備的結(jié)晶麥芽;b-商業(yè)市售的結(jié)晶麥芽圖4 結(jié)晶麥芽的剖面圖Fig.4 Profile of crystal malt

2.4.2 理化指標(biāo)分析

對(duì)結(jié)晶麥芽的還原糖含量、游離氨基氮含量、浸出率、色度、麥汁pH以及結(jié)晶麥芽的結(jié)晶率進(jìn)行測(cè)定，并與市售的結(jié)晶麥芽進(jìn)行了比較，結(jié)果如表3所示。由表3看出，在還原糖含量和色度上，本工藝制備的結(jié)晶麥芽與市售的相差不大，但游離氨基氮的含量顯著提高，高出了56.2%，浸出率也比市售結(jié)晶麥芽高12.1%。本工藝制備的結(jié)晶麥芽整體的結(jié)晶率也略高于市售的結(jié)晶麥芽。

表3 結(jié)晶麥芽的理化指標(biāo)比較Table 3 Comparison of physicochemical indicators of crystal malt

2.4.3 風(fēng)味分析

通過(guò)GC-MS分析了結(jié)晶麥芽的風(fēng)味物質(zhì)(圖5)，結(jié)晶麥芽的可揮發(fā)性成分主要以醛類為主，有18種，其次為酮類5種，吡嗪類4種，醇類3種，酚類3種，其他類3種。結(jié)晶麥芽的風(fēng)味以巧克力、奶油與焦糖風(fēng)味為主，并且有大量醛類物質(zhì)帶來(lái)的水果清香。由圖5可知，醛類含量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種類的物質(zhì)的，這與FICKERT等的報(bào)道相符[22]。在可揮發(fā)性成分的總濃度上，本工藝制備的結(jié)晶麥芽達(dá)到1 265 μg/L(其中醛類為1156.7 μg/L，酮類為7.7 μg/L，吡嗪類為5 μg/L，醇類為18.3 μg/L，酚類為30 μg/L，其他類為47.3 μg/L)，商業(yè)市售的只有637.8 μg/L(其中醛類為600 μg/L，酮類為2.9 μg/L，吡嗪類為1.7 μg/L，醇類為9.9 μg/L，酚類為9.1 μg/L，其他類為14.2 μg/L)，高出了98.3%。在主要的醛類風(fēng)味物質(zhì)上，本工藝制備的結(jié)晶麥芽是商業(yè)市售的2倍，主要成分為異丁醛、2-甲基丁醛和異戊醛，它們所帶來(lái)的是焦糖、巧克力、咖啡的風(fēng)味，這些也是結(jié)晶麥芽的標(biāo)志性風(fēng)味。這些醛類主要是通過(guò)美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物Strecker降解所得，與傳統(tǒng)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有差異的原因是結(jié)晶麥芽在制作過(guò)程中焙烤溫度較低，為120 ℃左右。在更高的溫度下，醛類物質(zhì)會(huì)形成類黑素，一種褐色的含氮聚合物和共聚物，然后進(jìn)一步形成傳統(tǒng)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，如吡嗪類、呋喃酮、麥芽酚等雜環(huán)化合物[23]。

圖5 結(jié)晶麥芽中可揮發(fā)性成分對(duì)比Fig.5 Comparison of volatile components in crystalline malt

3 結(jié)論

發(fā)芽84 h的綠麥芽在糖化后所測(cè)得的還原糖與游離氨基氮含量最高，選擇發(fā)芽84 h的綠麥芽作為制備結(jié)晶麥芽的原料。通過(guò)單因素和中心組合試驗(yàn)，確定了結(jié)晶麥芽的預(yù)糖化工藝，將發(fā)芽84 h的綠麥芽，在60 ℃，pH=3.36的條件下，進(jìn)行蛋白休止2 h，而后將溫度提升至71.1 ℃，糖化2 h，得到的綠麥芽焙烤之后就能夠得到優(yōu)質(zhì)結(jié)晶麥芽。優(yōu)質(zhì)結(jié)晶麥芽的結(jié)晶率為98%，且結(jié)晶麥芽?jī)?nèi)部能夠完全結(jié)晶，結(jié)晶品質(zhì)佳，風(fēng)味濃郁，特征明顯，風(fēng)味物質(zhì)含量比市場(chǎng)普通結(jié)晶麥芽提高了98.3 %。本研究結(jié)果為結(jié)晶麥芽的生產(chǎn)和工坊啤酒質(zhì)量的提高提供了技術(shù)參考。