羅強(qiáng)，劉杰，劉志剛

(深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳,518000)

白酒是由高粱等谷物經(jīng)蒸煮等多個(gè)過程制得。中醫(yī)認(rèn)為白酒可活血通脈、助藥力、增進(jìn)食欲、消除疲勞，而且還有健脾胃的功效[11]。雖有大量研究表明，酗酒會對機(jī)體造成損傷，但同時(shí)也有研究顯示，適量飲用白酒對人體健康有一定益處[2, 12]。白酒成分復(fù)雜，與人體健康的關(guān)系尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白酒中含有多種抗氧化性物質(zhì)，如有機(jī)酸、酚類、吡嗪類化合物、含硫及萜類化合物等[13-14]，但由于乙醇及水的存在及分離困難等原因，人們對白酒相關(guān)生物活性物質(zhì)研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過萃取、冷凍干燥的方式獲得醬香型白酒中的非乙醇物質(zhì)(MLE)，并對其進(jìn)行了抗氧化活性研究，以期解釋醬香型白酒中生物活性物質(zhì)的抗氧化活性功能，從而為功能型白酒的調(diào)配奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；醬香型白酒，貴州茅臺集團(tuán)；胎牛血清-FBS，中國杭州四季青生物技術(shù)有限公司；活性氧檢測試劑盒、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、Trizol、RT-PCR相關(guān)試劑，碧云天生物技術(shù)研究所；SOD、MDA、GSH-PX等相關(guān)測試盒，南京建成生物工程研究所；ExScript TM RT-PCT kit試劑盒， TaKaRa公司；其他試劑為分析純或標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IC型超凈工作臺、INCO2108型CO2培養(yǎng)箱，德國Thermo Fisher Scientific公司；TECAN infinite M200多功能酶標(biāo)儀，德國TECAN公司；2K15型低溫高速離心機(jī)、3-30K高速臺式冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司；Waters R2487高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)，美國Waters公司；液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS)，美國Agilent Technologies公司；Ultra-Turrax組織勻漿器，德國IKA公司；Epics Altra型流式細(xì)胞儀，美國Beckman公司；定量PCR儀，美國Bio-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MLE的分離及組成分析

250 mL分液漏斗中加入50 mL醬香型白酒、30 mL水和100 mL氯仿，振蕩搖勻，靜置，分離氯仿層，重復(fù)3次，合并氯仿層。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(0 ℃)除去氯仿獲得有機(jī)層化合物。真空凍干機(jī)凍干水層，獲得水層化合物，合并氯仿層及水層化合物即為MLE，LC/MS檢測結(jié)果顯示MLE中不含氯仿中所含的雜質(zhì)，將MLE在-20 ℃避光保存，HPLC-MS分析方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

3×105個(gè)/mL HepG2細(xì)胞接種于體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中(pH 7.2)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下孵育，培養(yǎng)液隔日更換。

實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、H2O2模型損傷組、53°醬香型白酒組、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE組及MLE成分組。將處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中孵育24 h；待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，實(shí)驗(yàn)組加入100 μg/mL溶于PBS的53°醬香白酒、V(乙醇)∶V(水)=53∶47、MLE和MLE成分，正常對照組、H2O2模型損傷組加入等量的PBS緩沖液，孵育6 h；棄去培養(yǎng)液，H2O2模型損傷組及實(shí)驗(yàn)組加入含有100 μmol/L H2O2的PBS緩沖液，正常對照組加入等體積的PBS緩沖液，孵育4 h，CCK8(cell counting kit-8)檢測細(xì)胞增殖能力[15]。

教師既是“經(jīng)師”，又是“人師”。教書和育人是一個(gè)無法分開的整體，育人滲透在教學(xué)中，是教學(xué)不可或缺的組成部分，育人效果的好壞直接決定著教學(xué)質(zhì)量的高低。通過教學(xué)，教師既要幫助學(xué)生掌握知識，形成技能，發(fā)展能力，又要幫助學(xué)生養(yǎng)成遠(yuǎn)大的理想追求，形成正確的人生態(tài)度，樂觀的情感體驗(yàn)，寬廣的人文情懷，堅(jiān)韌的意志品質(zhì)，精益求精的敬業(yè)精神。美國心理學(xué)家林格倫指出：“教師的教育效果取決于師生交往的質(zhì)量。”[2]要改變高等學(xué)校師生關(guān)系日漸疏遠(yuǎn)的現(xiàn)狀，教師要深入學(xué)生之中，親近學(xué)生，了解學(xué)生，與生為友，以理服生，以情動生，以身示生，真正成為學(xué)生的人生導(dǎo)師。

將處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞從105個(gè)/mL的濃度接種于96孔板上，共接種36個(gè)孔孵育24 h；待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，實(shí)驗(yàn)分組情況如下：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53%vol醬香型白酒組；④53%乙醇組(體積分?jǐn)?shù))；⑤MLE組；⑥MLE-10組。③、④、⑤、⑥組每孔分別加入100 μL溶于PBS的53°醬香型白酒、體積分?jǐn)?shù)53%乙醇、MLE、MLE-10溶液，濃度均為0.248 mg/mL，①、②組每孔加入100 μL的PBS緩沖液；孵育6 h后，棄去培養(yǎng)液；②、③、④、⑤、⑥組加入100 μL濃度為100 μmol/L的H2O2溶液，①組加入等體積的PBS緩沖液；孵育4 h后每孔加入100 μL培養(yǎng)基和20 μL 5 g/L的MTT并溫育4 h，去除培養(yǎng)液及cck-8，每孔加入200 μL PBS緩沖液，酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度。

1.3.3 檢測MLE對細(xì)胞ROS、抗氧化酶的影響

實(shí)驗(yàn)分組同cck-8法檢測細(xì)胞存活率，取對數(shù)生長期細(xì)胞，從104個(gè)/mL密度接種于96孔板培育24 h，加藥物孵育6 h，棄上清液，加100 μmol/L H2O2孵育4 h，然后按試劑盒說明書檢測ROS及GPx、SOD、MDA等的水平。

1.4 總RNA提取和cDNA的合成

總RNA提取和cDNA的合成分別應(yīng)用Total RNA提取試劑盒和兩步法cDNA合成試劑盒，依試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)GenBank中NQO1、HO-1、PI3K、Nrf2和β-actin mRNA序列，利用Premier 5.0 設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。

1.5 檢測抗氧化酶基因的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green I染料法，按照ExScript TM RT-PCR Kit試劑盒操作說明書在定量PCR儀進(jìn)行。采用總反應(yīng)體積10.0 μL體系：SYBR-Premix ExTaqTMⅡ 5 μL，引物(10 μmol/L)2.0 μL，cDNA模版1.0 μL，雙蒸水2.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性200 s，95 ℃反應(yīng)25 s，65 ℃反應(yīng)25 s，72 ℃反應(yīng)20 s，72 ℃作用120 s，熒光檢測72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。表達(dá)水平用相對定量的方法，采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。陰性對照和陽性對照采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對MLE處理效應(yīng)進(jìn)行回歸分析。P<0.05定為具有顯著性差異，結(jié)果均以Mean±SEM表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MLE的分離提取及化合物分析

50 mL白酒經(jīng)萃取、冷凍干燥，最終獲得MLE 0.35 mg。經(jīng)HPLC-MS分析，MLE多為多元醇、不飽和脂肪酸及其酯類化合物、吡嗪類化合物及含有苯環(huán)的芳香族化合物，選出其中含量較多的16種化合物(表1)及MLE進(jìn)行體外抗氧化活性研究。

2.2 MLE對HepG2細(xì)胞增殖能力及ROS含量的影響

取0.10 mg/mL化合物(表1)預(yù)處理細(xì)胞6 h后，加入100 μmol/L H2O2培養(yǎng)4 h，CCK8檢測細(xì)胞增殖能力。相比于正常對照組(細(xì)胞增殖能力設(shè)為100%)，H2O2組細(xì)胞增殖能力顯著下降(83.3%,P<0.05)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分化合物可顯著抑制由H2O2誘導(dǎo)引起的細(xì)胞增殖能力減弱的現(xiàn)象(表1)。MLE-7、MLE-9、MLE-10及MLE-15與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)6 h后，細(xì)胞增殖能力分別比H2O2組高6.40%、8.80%、13.2%及10.9%。而細(xì)胞與MLE-2、MLE-3、MLE-8及MLE-14共培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖能力與H2O2組相比分別降低了7.00%、10.7%、11.0%及10.6%。因此，選擇MLE-10與MLE進(jìn)行抗氧化活性研究。

表1 MLE中相關(guān)化合物濃度及對HepG2細(xì)胞增殖能力的影響Table 1 Concentrations of compounds in the MLE and effects on proliferation of HepG2 cells

注：“-”表示編號代表的物質(zhì)為混合物。

實(shí)驗(yàn)分為：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53%vol醬香型白酒組；④V(乙醇)∶V(水)=53∶47；⑤MLE組；⑥MLE-10組。為便于比較，將正常對照組數(shù)值設(shè)為1，其他組為相對值。

圖1-A結(jié)果顯示，相比于正常組相比，經(jīng)H2O2組細(xì)胞存活率降低14.4%(P<0.05)。與H2O2組相比，MLE、MLE-10處理后細(xì)胞存活率分別上升5.80%、10.6%。相比于正常組，白酒、乙醇組細(xì)胞存活率分別下降17.7%、21.7%，低于H2O2組。說明白酒和乙醇會降低細(xì)胞抗H2O2氧化損傷能力，使細(xì)胞存活率降低。

MLE對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響如圖1-B所示，與正常組相比，H2O2刺激后，細(xì)胞內(nèi)ROS升高338% (P<0.05)。而MLE、MLE-10處理后，與H2O2組比較，細(xì)胞內(nèi)ROS分別下降24.7%、47.9% (P<0.05)，細(xì)胞清除ROS能力顯著增強(qiáng)。而白酒、乙醇組的ROS卻高于H2O2組，推測是乙醇與H2O2協(xié)同降低了HepG2細(xì)胞清除ROS的能力。

A-細(xì)胞存活率；B-ROS圖1 MLE對HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響Fig.1 Effects of MLE on proliferation and ROS level in HepG2 cells注：與正常對照組比較，#表示差異顯著(P<0.05)，與H2O2模型損傷組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 MLE對HepG2細(xì)胞相關(guān)抗氧化酶的影響

實(shí)驗(yàn)分為：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53°醬香型白酒組；④V(乙醇)∶V(水)=53∶47；⑤MLE組；⑥MLE-10組。為便于比較，將正常對照組數(shù)值設(shè)為1，其他組為相對值。

由表2可知，H2O2刺激HepG2細(xì)胞后，GST、MDA的含量顯著升高(P<0.05)，GPx、SOD、CAT活性出現(xiàn)明顯降低，且GSH含量也顯著降低。經(jīng)MLE、MLE-10處理后，GST、MDA的含量降低(P<0.05)，GPx(P<0.05)、SOD、CAT活性明顯增強(qiáng)。不同于MLE、MLE-10可增強(qiáng)HepG2抗氧化損傷的作用，醬香型白酒及同濃度乙醇組的GST、MDA的含量反而高于H2O2組，而GPx、SOD、CAT活性則低于H2O2組。推測可能是組分中乙醇對細(xì)胞具有一定的氧化損傷作用導(dǎo)致的。

2.4 MLE對HepG2細(xì)胞抗氧化基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)分為：①正常對照組；②H2O2模型損傷組；③53°醬香型白酒組；④V(乙醇)∶V(水)=53∶47；⑤MLE組；⑥MLE-10組。為便于比較，將正常對照組數(shù)值設(shè)為1，其他組為相對值。

如圖2所示，用H2O2刺激HepG2細(xì)胞后，與對照組相比，HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)。MLE-10處理后，其表達(dá)明顯提高(與H2O2模型損傷組比較，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，H2O2可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)下降。而MLE、MLE-10可抑制H2O2所致的抗氧化基因表達(dá)下調(diào)，使之恢復(fù)，并接近正常水平。

表2 MLE對HepG2細(xì)胞內(nèi)GPx、SOD、CAT、GSH、GST及MDA的影響Table 2 Effects of MLE on GPx, SOD, CAT, GSH, GST and MDA in HepG2 cells

注：與正常對照組對比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)，與H2O2模型損傷組比，*表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 MLE對H2O2處理HepG2細(xì)胞HO-1、NQO-1、Nrf2及PI3K基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of MLE on HO-1, NQO-1, Nrf2 and PI3K gene expressions in HepG2 cells注：與正常對照組對比，#表示差異顯著(P<0.05)，與H2O2模型損傷組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化和抗氧化水平失去平衡的結(jié)果，過量的活性氧會引起分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷[17]。大量研究表明，氧化應(yīng)激是代謝綜合征發(fā)生和發(fā)展及一些疾病發(fā)生的重要病因之一[18-19]。在肝炎、酒精肝等多種肝病中，氧化應(yīng)激是它們共同的損傷機(jī)制[20]。H2O2可直接轉(zhuǎn)變?yōu)椤H作用于肝細(xì)胞，引起細(xì)胞氧化損傷[21]。大量研究表明，酒精及其代謝產(chǎn)物會對機(jī)體造成一定的損傷，尤其是對消化系統(tǒng)。不同于伏特加等蒸餾酒，醬香型白酒是一種由谷物發(fā)酵(如高粱等)經(jīng)蒸煮等多種過程而得的蒸餾酒，它在含有酒精的同時(shí)還含有大量生物活性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，醬香型白酒中含有多種酯類、不飽和烯醇及含有苯環(huán)的芳香族化合物。其中化合物MLE-10(2-乙酰基-5-甲基呋喃)能顯著增強(qiáng)細(xì)胞抗H2O2造成的氧化損傷。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，MLE及MLE-10可提高細(xì)胞Nrf2及其上游調(diào)控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1和HO-1的表達(dá)，進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GPx等抗氧化酶活性，降低MDA產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基能力，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[22]。但是，與相關(guān)研究結(jié)果類似，酒精組及白酒組細(xì)胞抗氧化能力降低、相關(guān)抗氧化酶活性低于H2O2組，說明乙醇降低了細(xì)胞的抗氧化損傷能力。