劉文靜，程晗，陳崇藝，柴春月*，田龍,2，周索

1(南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽，473061) 2(河南省菌類食品工程技術(shù)研究中心，河南 南陽,473061)

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)即纖維二糖酶(cellobias，CB)[1]，可催化水解烴基或芳香基與糖基原子團(tuán)間的糖苷鍵，生成葡萄糖并釋放相應(yīng)的配基[2]。高活性的β-葡萄糖苷酶可有效降解纖維二糖，從而提高纖維素酶系的作用效率[3]。此外，β-葡萄糖苷酶在食品、紡織、飼料、造紙和醫(yī)藥等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[4-5]。

β-葡萄糖苷酶存在于多種生物體中[6]。植物源β-葡萄糖苷酶活性低且不穩(wěn)定，目前國內(nèi)外研究所用的β-葡萄糖苷酶主要來源于微生物[7]。2016年，YAO等[8]利用基因工程手段對(duì)草酸青霉進(jìn)行改造，得到了優(yōu)良的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶突變菌株；2017年，李永博等[9]從濃香型大曲中分離出1株β-葡萄糖苷酶活力達(dá)到55.7 U/mL的枯草芽孢桿菌；2018年，王鳳梅等[10]從340株葡萄酒相關(guān)酵母菌株中篩選得到66株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株并研究了部分菌株的理化性質(zhì)。多項(xiàng)研究表明，從自然界分離所得菌株的β-葡萄糖苷酶活力普遍偏低[11]，運(yùn)用各種誘變手段對(duì)野生菌種進(jìn)行改造，是獲得高產(chǎn)酶活力菌株的有效方法之一[12]。

誘變育種具有高效便捷的優(yōu)點(diǎn)，常用的誘變方法有物理誘變、化學(xué)誘變、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變等[13]。用單一的誘變方式得到目的突變株的可能性較低，復(fù)合誘變是一種能夠大大提高菌株正向突變概率的方法[14]。本研究從腐木樣品中分離得到1株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的青霉菌株；先后用ARTP誘變和硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)誘變方法對(duì)該菌株進(jìn)行誘變，結(jié)合七葉苷平板法[15]初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終獲得酶活力顯著提升且遺傳穩(wěn)定的突變株；最后通過響應(yīng)面法[16-18]對(duì)所得突變菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高其酶活力。本實(shí)驗(yàn)旨在為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的開發(fā)和應(yīng)用提供高效菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

2018年1月份，在河南南陽獨(dú)山森林公園隨機(jī)挑選10個(gè)地點(diǎn)，每個(gè)地點(diǎn)相距約500 m，采集腐木樣品，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)，封袋，并在每個(gè)袋上記錄下取樣地點(diǎn)和時(shí)間，置于4 ℃保存，備用。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZWYR-D2403恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；ARTP誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；JW-2019H臺(tái)式高速離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；V-1200分光光度計(jì)，翰藝儀器(上海)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基：200 g土豆去皮切塊，加純水煮沸30 min后用4層紗布過濾，將濾液用ddH2O定容至1 L，分別加入20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉，完全溶解后分裝入三角瓶中，待滅菌。

七葉苷培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉3 g，NaCl 5 g，七葉苷0.1 g，檸檬酸鐵銨0.2 g，加dd H2O 1 L，溶解后加入15 g瓊脂粉，混勻分裝入三角瓶中，待滅菌。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(每100 mL)：3 g麩皮，0.4 g (NH4)2SO4，0.6 g KH2PO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.05 g CaCl2，0.01 g FeSO4。

所有培養(yǎng)基均在0.1 MP，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

分別稱取采集于10個(gè)不同地點(diǎn)的腐木樣品5 g，在無菌研缽中充分研碎，過40目篩，除去雜質(zhì)和未研碎的大顆粒物。將所有腐木粉置入100 mL無菌離心管內(nèi)，在振蕩器上連續(xù)振蕩10 min，將樣品混勻。從上述混合樣品中稱取1 g腐木粉，加20 mL ddH2O，轉(zhuǎn)入100 mL無菌錐形瓶中，28 ℃，150 r/min振蕩30 min，取出靜置20 min，取上清液以10倍的濃度梯度差進(jìn)行稀釋，分別將10-3、10-4和10-5倍稀釋液涂布于PDA平板(含50 μg/mL的氨芐青霉素)上，倒置，28 ℃恒溫培養(yǎng)。每天觀察，及時(shí)分離新長(zhǎng)出的菌落，并多次純化至純培養(yǎng)。用七葉苷培養(yǎng)基定性檢測(cè)純化菌株是否產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，根據(jù)變色圈的大小和顏色，挑選相關(guān)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，定量測(cè)定發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活力。

1.2.2 酶活測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液稀釋10倍后得到粗酶液。參考劉德海[19]的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.161 3x-0.005 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，再檢測(cè)酶活。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài)觀察

將復(fù)篩所得菌株接種在PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d，觀察菌落的生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)和顏色等。插片法觀察菌絲形態(tài)，孢子大小和形態(tài)等。

1.2.3.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法[20]提菌株基因組，在生工生物公司合成引物ITS序列通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCT-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；持家基因BenA引物Bt2a：5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’和Bt2b：5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’[21]，總反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各1 μL，rTaq 0.15 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，dd H2O 17 μL，g DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)33次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢查，根據(jù)其結(jié)果，挑選相關(guān)PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司測(cè)序，將測(cè)序成功的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 復(fù)合誘變

1.2.4.1 孢子懸液的制備

用15%的無菌甘油沖洗培養(yǎng)7 d的固體平板，收集菌懸液于小三角瓶中，在28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)1 h，用8層無菌紗布過濾，得到單孢子懸浮液，用15%的無菌甘油將其定容至108個(gè)/mL，備用。

1.2.4.2 ARTP誘變

參考ZOU等[22]的方法，把加有10 μL孢子懸液的圓形鐵片放在操作室的凹槽中，設(shè)置電源功率110 W，氣流量10 SLM，處理距離為2 mm，分別處理0、30、60、90、120、150，180、210、240、270、300 s。將處理完的小鐵片分別放入裝有1 mL無菌水的EP管中，振蕩混勻后進(jìn)行梯度稀釋，取100 μL 10-3倍稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

選取致死率為80%的照射時(shí)間對(duì)菌株進(jìn)行誘變，挑取形態(tài)發(fā)生較大變化的單菌落于七葉苷平板上，培養(yǎng)2～3 d后觀察產(chǎn)酶變色圈的大小，根據(jù)其結(jié)果，選取變色圈較大的菌株進(jìn)行活化，通過發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活力，挑選酶活力提高最大的突變菌株，10 ℃斜面保存，備用。

1.2.4.3 DES化學(xué)誘變

以ARTP誘變篩選到的高酶活突變菌株，制備孢子懸液，方法同1.2.4.1。參考文獻(xiàn)[23]，具體方法如下：每0.1 mL孢子懸液加9.9 mL磷酸緩沖液(pH 7.0)，分別加入0、20、40、60、80、100 μL DES原液，使DES的體積分?jǐn)?shù)為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)20 min，加入1 mL Na2S2O3溶液終止反應(yīng)，混勻后進(jìn)行10倍濃度差的梯度稀釋，將100 μL 10-3倍稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，計(jì)算單菌落和致死率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。參照ARTP誘變篩選高產(chǎn)菌方法進(jìn)行酶活力提高的突變株篩選。

1.2.4.4 遺傳穩(wěn)定性研究

將篩選得到的高產(chǎn)酶菌株，依次連續(xù)傳代培養(yǎng)6次，測(cè)定每個(gè)時(shí)代各菌株發(fā)酵液酶活力，判斷突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。挑選經(jīng)過6次傳代，酶活力變化幅度不明顯的菌株，于10 ℃斜面保存，備用。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

Plackett-Burman預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，碳源添加量、氮源添加量和裝液量3個(gè)因素的P值都小于0.05，這3個(gè)因素是影響發(fā)酵條件和酶活力的顯著因素性，因此，選擇這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。

用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選擇三因素三水平實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值為酶活力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素及水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株篩選

2.1.1 七葉苷平板初篩

將分離純化的菌株接種在七葉苷平板上，觀察菌落生長(zhǎng)情況和培養(yǎng)基顏色變化，從26種菌株中挑選出9種產(chǎn)酶變色圈較大的菌株，編號(hào)為L(zhǎng)1～L9，如圖1所示。

圖1 七葉苷平板初篩產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株Fig.1 Preliminary screening of strains producing β-glucosidase on esculin agar plates 注：圖中L1～L9為菌株編號(hào)。

L1菌株的產(chǎn)酶變色圈明顯大于其它菌株，且顏色深于其它菌株，推測(cè)L1菌株可能有較高的β-葡萄糖苷酶活性，因此初步確定以L1作為后續(xù)研究菌株。

2.1.2 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

為定量測(cè)定L1～L9這9個(gè)菌株的β-葡萄糖苷酶活力，用基礎(chǔ)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，分別對(duì)這9個(gè)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，5 d后測(cè)定各發(fā)酵液酶活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取酶活平均值，結(jié)果見圖2。

圖2 L1～L9菌株發(fā)酵液的β-葡萄糖苷酶活統(tǒng)計(jì)Fig.2 The activity of β-glucosidase in fermentation broth of strain L1～L9

定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L1菌株經(jīng)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，其酶活力平均值達(dá)34.85 U/mL，L2～L9菌株的酶活力平均值依次為24.49、16.98、7.92、10.00、20.17、14.00、26.91和22.03 U/mL，L1菌株酶活力最高，結(jié)合2.1.1定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇L1作為后續(xù)誘變及發(fā)酵產(chǎn)酶菌株。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株L1接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，可以看到該菌株菌落的中間呈灰綠色粉末狀，且表面有滲出液，菌落邊緣呈白色氣生菌絲，菌落背面為米白色，如圖3-a、3-b所示。用插片法觀察L1在PDA平板上培養(yǎng)3 d后的菌絲顯微形態(tài)，如圖3-c所示，該菌株形成無隔菌絲，分生孢子頭頂端膨大成典型的掃帚狀，分生孢子呈球形，直徑約2.5 μm，是典型的青霉菌屬形態(tài)特征，推測(cè)該菌株可能是青霉屬的一個(gè)種。

圖3 菌株L1在PDA平板上的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)(C圖中比例尺為20 μm)Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain L1 on PDA plate

2.2.2 分子鑒定

為了鑒定該菌株，以其基因組DNA為模板，分別以ITS1/ITS4和Bt2a/Bt2b為引物，擴(kuò)增L1菌株的ITS序列和持家基因BenA。獲得了長(zhǎng)度為545 bp的ITS序列和414 bp的BenA序列，將序列分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，L1菌株的ITS序列與已報(bào)道的赭綠青霉(Penicilliumochrochloron)的序列相似性達(dá)99.45%，持家基因BenA與P.ochrochloron的序列相似性達(dá)94.21%，結(jié)合菌株形態(tài)特征以及分子鑒定的結(jié)果，認(rèn)為L(zhǎng)1菌株屬于青霉屬的P.ochrochloron。根據(jù)序列的相似性比對(duì)結(jié)果，挑選相關(guān)菌株的BenA和ITS序列，將2個(gè)序列進(jìn)行組合，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，光滑青霉菌(P.glabrum)為外群。

圖4 最大似然法構(gòu)建菌株L1基于BenA和ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree obtained Maximum-Likelihood analysis based on a combined data set of BenA and ITS sequences of strain L1

2.3 誘變結(jié)果

2.3.1 ARTP誘變

2.3.1.1 致死率曲線

ARTP誘變中的等離子體富含多種化學(xué)活性粒子，能引起細(xì)胞膜通透性和蛋白質(zhì)物質(zhì)發(fā)生改變，同時(shí)會(huì)造成菌株DNA的損傷，導(dǎo)致照射時(shí)間越長(zhǎng)，菌株的存活率就越低。為確定最佳誘變時(shí)間，將L1菌株的孢子懸浮液置于ARTP誘變儀中，分別照射0、30、60、90、120、150，180、210、240、270和300 s，將照射后的懸浮液進(jìn)行稀釋，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中關(guān)于不同濃度孢子懸液與單菌落數(shù)的關(guān)系(結(jié)果未顯示)，選擇10-3倍稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2 d，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)各個(gè)平板上單菌落數(shù)，取平均值，制作誘變時(shí)間-致死率曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 ARTP誘變不同時(shí)間的致死率曲線Fig.5 Curve of the mutagenized death rate of different ARTP mutation time

不同處理時(shí)間所對(duì)應(yīng)的單菌落數(shù)分別為225、162、149、128、112、106、79、58、45、25、5，對(duì)應(yīng)致死率分別為：0、28%、34%、43%、50%、53%、65%、74%、80%、89%和98%。由此可見，不同的誘變時(shí)間導(dǎo)致菌株致死率變化較大，對(duì)于ARTP和DES誘變來說，通常選擇致死率為75%～85%所對(duì)應(yīng)的誘變條件為最佳參數(shù)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，ARTP誘變時(shí)間為240 s，致死率為80%。因此，選擇對(duì)L1菌株的ARTP最佳誘變時(shí)間為240 s。

2.3.1.2 ARTP誘變突變株酶活力測(cè)定

以L1為出發(fā)菌株，以240 s作為ARTP誘變的最佳時(shí)間進(jìn)行誘變，挑選與出發(fā)菌株L1有較大形態(tài)差異的40～50個(gè)突變菌，定性檢測(cè)這些菌株在七葉苷平板上的產(chǎn)酶變色圈，篩選出8～10株產(chǎn)酶變色圈較大的突變株，將其活化后通過搖瓶發(fā)酵，測(cè)定酶活力，重復(fù)ARTP誘變20次。結(jié)果共篩選出180株在七葉苷平板上產(chǎn)酶變色圈較大突變菌株，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶酶活力測(cè)定，結(jié)果顯示，其中有15株突變菌株的酶活力提高明顯，與出發(fā)菌株L1相比，提高比例高于40%，15株突變菌株的編號(hào)依次為：A-1～A-15，結(jié)果如圖6所示。其中，突變菌株A-2的發(fā)酵液酶活力為57.84 U/mL，比出發(fā)菌株L1的酶活提高了52%，高于所有突變株酶活力，故挑選該菌株作為后續(xù)DES誘變處理的出發(fā)菌株。

圖6 ARTP誘變部分突變株與L1菌株的β-葡萄糖苷酶活比較Fig.6 Comparison of the partially ARTP mutation strains and the strain L1 on β-glucosidase activity

2.3.2 DES誘變

2.3.2.1 致死率曲線

DES是一種高效化學(xué)誘變劑，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1%的DES濃度對(duì)突變菌株A-2的致死率已接近100%。為確定最佳的誘變劑量，設(shè)置0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0% DES體積分?jǐn)?shù)梯度，對(duì)應(yīng)平板單菌落個(gè)數(shù)分別為272、202、143、94、54和7，其致死率分別為0、25%、47%、65%、80%和97%，制作DES濃度-致死率曲線，如圖7所示?？紤]到誘變致死率為75%～85%之間時(shí)正突變比例較高[24]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.8% DES體積分?jǐn)?shù)作為最佳誘變劑量。

圖7 DES誘變致死率曲線Fig.7 Lethality of DES concentration to strain A-2

2.3.2.2 DES誘變突變株酶活力測(cè)定

以ARTP誘變篩選到的突變菌株A-2為出發(fā)菌株，進(jìn)行DES化學(xué)誘變，高產(chǎn)酶突變菌株的初篩方法同ARTP誘變，共挑選出100株在七葉苷平板上產(chǎn)酶變色圈較大的突變菌，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，計(jì)算各突變菌株酶活，并與出菌株A-2的酶活進(jìn)行比較，最終挑選出10株酶活提高30%以上的突變株，突變菌株編號(hào)依次為D-1～D-10，結(jié)果見圖8所示，其中，D-6菌株酶活力為94.74 U/mL，高于其他各突變菌株，且比出發(fā)菌株A-2的酶活力提高了75.1%，比初始菌株L1提高了148.2%。

圖8 DES誘變部分突變株與A-2菌株的β-葡萄糖苷酶活比較Fig.8 Comparison of the partially DES mutation strains and the strain A-2 on β-glucosidase activity

2.3.3 遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)

為檢測(cè)產(chǎn)酶活力明顯提高的突變株D-6的遺產(chǎn)穩(wěn)定性，將突變株D-6依次傳代培養(yǎng)6次，對(duì)每一代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定各代菌株的β-葡萄糖苷酶活力，以酶活力平均值-傳代次數(shù)作圖，結(jié)果見圖9，各代菌株的酶活力分別為：94.94、91.79、93.54、92.89、92.07和90.90 U/mL，不同世代酶活力差異不顯著，表明突變株D-6的遺傳穩(wěn)定性良好，可作為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)菌株。

圖9 突變菌株D-6的發(fā)酵液酶活穩(wěn)定性檢測(cè)Fig.9 Detection of enzyme activity stability in fermentation broth of mutant strain D-6

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.4.1 Box-Behnken響應(yīng)面分拆

Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，酶活力Y與顯著因子之間的回歸方程為：

模型中二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明該模型拋物面開口向下，有極大值點(diǎn)。該模型的R2值為0.983 4，校正系數(shù)R2Adj值為0.962 1，表明回歸模型可以說明98.34%響應(yīng)值的變化，說明該模型擬合程度高，能較好地預(yù)測(cè)發(fā)酵條件與菌株產(chǎn)酶活性的關(guān)系，精密度大于4.0，視為合理且擬合程度良好。回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小決定了各因素對(duì)響應(yīng)值影響的主次順序，本實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)響應(yīng)值影響排序?yàn)椋貉b液量(X5)>碳源添加量(X1)>氮源添加量(X2)。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design combination and results

方差分析表明，模型P值小于0.000 1，說明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.162 8，大于0.05，說明此模型建立有效。綜合以上回歸模型分析和預(yù)測(cè)發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶活性影響的結(jié)果，回歸模型系數(shù)顯著性結(jié)果顯示，X5-裝液量的一次項(xiàng)、X1-碳源添加量的一二次項(xiàng)對(duì)菌株產(chǎn)酶活性回歸模型影響顯著(P<0.05)，X2-氮源添加量一次項(xiàng)對(duì)菌株產(chǎn)酶活性回歸模型影響不顯著(P>0.05)。3個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)該模型的影響均不顯著(P>0.05)，3因素的交互項(xiàng)影響均不顯著(P>0.05)。

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)最佳條件與模型驗(yàn)證

對(duì)碳源添加量(X1)、氮源添加量(X2)、裝液量(X5)進(jìn)行交互分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素均存在極值點(diǎn)，且響應(yīng)面覆蓋了最大值所在的區(qū)域。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得到的最佳產(chǎn)酶條件是：KH2PO46 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO40.1 g/L，初始pH 5.2，接種量5%(孢子濃度108個(gè)/mL)，碳源添加量(X1) 玉米秸稈45.74 g/L、氮源添加量(X2) (NH4)2SO47.23 g/L、裝液量(X5) 63.21 mL/250 mL，發(fā)酵溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間132 h，D-6菌株的β-葡萄糖苷酶活力為143.88 U/mL。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明，D-6菌株的酶活力均值為142.92 U/mL，與預(yù)測(cè)值的誤差很小，且與基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵后的酶活92.69 U/mL相比，酶活提高了54.2%。綜上所述，響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

從腐木樣品中分離出來1株可以產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的青霉菌株L1，經(jīng)過ARTP-DES復(fù)合誘變獲得1株具有較好遺傳穩(wěn)定性的突變菌株D-6，其發(fā)酵液酶活力比初始菌株L1提高了148.2%。通過響應(yīng)面法進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)合軟件分析和實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，得到D-6突變株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳條件，且在此條件下，測(cè)得菌株酶活力可達(dá)142.92 U/mL，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)酶活提高了54.2%；與出發(fā)菌株L1相比，酶活力提升了274.4%。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)建立的二次回歸模型準(zhǔn)確有效，可用來預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)酶條件曲工藝參數(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)有較好擬合性，具有一定的實(shí)用價(jià)值。