陳馨濃， 葛其卉， 趙一璇， 郭曉辰， 張軍平

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300381）

1 概述

訓練免疫是指固有免疫細胞［包括單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DC）等］接受抗原刺激后產生免疫記憶，當再次受到相同或不同刺激時，產生更加強烈的免疫應答［1-2］。作為一種新的免疫模式，訓練免疫與適應性免疫記憶不同。適應性免疫記憶是由T 和B 淋巴細胞誘導的長期記憶，該過程對所涉及的抗原具有高度特異性，并由V-D-J基因重組介導；訓練免疫由固有免疫細胞誘導，持續(xù)時間較短，且訓練免疫通常為非特異性，免疫反應增強與細胞內代謝和組蛋白修飾水平的表觀遺傳調控有關，并不涉及基因突變和重組［3］。

組蛋白修飾是訓練免疫的核心機制；此外，DNA甲基化及微小RNA（microRNA，miRNA）和（或）長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）表達調控可能發(fā)揮一定作用［4］。這些轉錄程序的變化不僅使細胞內的免疫信號重新連接，而且誘導細胞代謝從氧化磷酸化向需氧糖酵解轉變，從而提高對刺激的反應能力［2］。雖然訓練免疫為機體的一種適應性反應，但當其被不適當地激活時，可誘導慢性炎癥反應，加劇組織損傷［1］。

2 訓練免疫與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的相關性

AS 是缺血性心血管疾病的主要病理基礎，其特征是脂質代謝失衡和動脈壁炎癥反應。脂質和免疫細胞之間的相互作用是促進AS 病程中慢性炎癥的主要因素，其中氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）和單核/巨噬細胞是關鍵［5］。最近研究發(fā)現訓練免疫與AS 關系密切，主要表現為單核/巨噬細胞受到ox-LDL 刺激后，通過細胞內代謝和表觀遺傳重組，誘導長期的促炎表型［4，6］。因此，靶向干預訓練免疫相關單核/巨噬細胞功能、減少ox-LDL 的影響或調整訓練免疫機制可能成為恢復AS免疫穩(wěn)態(tài)的有效策略。

2.1 單核/巨噬細胞與訓練免疫的關系 單核/巨噬細胞作為AS 病變中最豐富的免疫細胞，可以協調脂質代謝和炎癥反應，對于調控斑塊的形成和穩(wěn)定性具有決定性作用［7-8］。當單核細胞接受刺激誘發(fā)訓練免疫時，可誘導促炎基因活化及細胞因子生成，在此過程中促炎細胞因子的表觀遺傳修飾起重要作用［6］。此外，經過訓練的單核細胞和巨噬細胞可促進糖酵解并增加谷氨酰胺分解，進入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)，其中間代謝物共同調節(jié)表觀遺傳相關酶的活性，最終通過激活組蛋白標記并增加染色質可及性（chromatin accessibility），長期誘導促炎基因轉錄［9-10］。臨床研究同樣發(fā)現，有癥狀的AS 患者的循環(huán)單核細胞具有促炎表型，且糖酵解酶表達增加，這些變化與組蛋白甲基化水平的表觀遺傳重塑相關［11］。

值得注意的是，訓練免疫造成AS 的不利影響不僅限于產生促炎細胞因子，還包括編碼基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）基因的表觀遺傳重編程增加了斑塊破裂的易損性、清道夫受體（scavenger receptor，SR）參與泡沫細胞形成、趨化因子負責招募循環(huán)免疫細胞等［12］。目前，關于AS 相關訓練免疫的體外研究主要集中在單核/巨噬細胞分化方面，即了解單核細胞向巨噬細胞分化之前和分化過程中如何積累免疫記憶［13］?？傊?，在AS 背景下，針對單核/巨噬細胞的訓練免疫機制，可開發(fā)防治疾病的新藥理靶點。

2.2 ox-LDL 與訓練免疫的關系 早先研究報道微生物及其產物（包括白色念珠菌或β-葡聚糖）是誘導訓練免疫的刺激源。后來Bekkering 等［14-16］通過研究發(fā)現，在沒有持續(xù)感染的情況下單核/巨噬細胞的訓練免疫也可被誘導，即ox-LDL 可通過組蛋白修飾誘導巨噬細胞長時間的促炎表型。ox-LDL是一種損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），與髓細胞表面受體CD36 結合，能夠使促AS 細胞因子和趨化因子［包括白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和單核細胞趨化蛋白 1］產生增加［15，17］。另外，在訓練免疫的單核細胞中 MMP2 和MMP9 的mRNA 表達顯著增高，增加了斑塊的易損性；SR-A 和CD36的表達增高，而膽固醇流出轉運蛋白ATP 結合盒轉運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和ABCG1 的表達降低，從而促進泡沫細胞形成［18-20］?？傊琽x-LDL 作為AS 相關的內源性無菌化合物，是促進單核/巨噬細胞訓練免疫的重要刺激源，而天然LDL 無法在體外誘導訓練免疫［15］。

通路分析顯示，ox-LDL 誘導的訓練免疫依賴于Toll 樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）和TLR4，以及細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷 脂 酰肌醇 3-激酶 的 激活［15］。Sohrabi 等［21］研究表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）依賴性活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生控制了ox-LDL 誘導人單核細胞來源巨噬細胞的訓練免疫表型。藥理學調節(jié)相關通路可能為治療AS 過程中單核細胞異常活化誘導的慢性炎癥提供了一種潛在方法。

2.3 炎性體（inflammasome）激活在訓練免疫中的作用 炎性體激活與AS 關系密切。最近有關炎性體通路的代謝調控和固有免疫的研究也逐漸受到重視［22］。斑塊巨噬細胞中細胞代謝紊亂多數與含pyrin結構域的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體活化有關，包括釋放溶酶體組織蛋白酶、線粒體ROS、細胞外ATP 等［23］。一項關于功能性訓練免疫的數量性狀位點分析研究表明，參與IL-1β信號傳遞的含胱天蛋白酶募集結構域凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和IL-1受體輔助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL1RAP）的單核苷酸多態(tài)性與ox-LDL 誘導訓練免疫的能力顯著相關［24］。事實上，IL-1β 對調控表觀遺傳重編程至關重要［25］。炎性體是調節(jié)IL-1β 成熟和釋放機制的核心。Duewell 等［26］的離體研究表明膽固醇晶體激活巨噬細胞中的NLRP3 炎性體。ox-LDL攝取增加可通過CD36導致細胞內膽固醇晶體成核，破壞溶酶體穩(wěn)定性，從而降低膽固醇和脂肪酸的新陳代謝，并且激活NLRP3炎性體，產生IL-1β［27］。

為了證明誘導訓練免疫是否需要NLRP3 炎性體，Christ 等［28］進行了相關研究，發(fā)現喂養(yǎng)西方飲食可促進低密度脂蛋白受體敲除（low-density lipoprotein receptor knockout，LDLR-/-）小鼠髓系祖細胞的表觀遺傳和轉錄重編程，誘導單核細胞促炎表型，且這些變化在小鼠換回常規(guī)飲食后仍然存在，所涉及的表觀遺傳修飾依賴于NLRP3 炎性體激活及IL-1β 分泌。這一研究結果表明新陳代謝、表觀遺傳重編程和炎性體之間存在交叉對話，共同驅動高脂飲食誘導的訓練免疫［24］。然而飲食誘導的訓練免疫是否直接影響斑塊形成仍未被證實，針對二者相關性的研究對于確認訓練免疫影響AS 形成的機制至關重要，需要進一步探索［13，29］。盡管高膽固醇促進單核細胞訓練免疫，但使用他汀類藥物降脂并不會逆轉這種促炎表型［30］。需要注意的是，在高脂或高膽固醇環(huán)境下，固有免疫訓練不僅在循環(huán)單核細胞中發(fā)生，也可見于骨髓祖細胞，其中髓樣前體細胞的長期表觀遺傳重編程，確保了固有免疫細胞長時間過度活化，促進AS發(fā)展［31-32］。研究發(fā)現骨髓細胞中膽固醇的積累可以激活NLRP3炎性體，增加AS斑塊內中性粒細胞積累和網狀病變數量［33］。此外，與AS 相關的醛固酮水平升高，可通過上調表觀遺傳介導的脂肪酸合成，誘導單核/巨噬細胞訓練免疫［34］。

ox-LDL 或高脂飲食誘導NLRP3 炎性體激活和IL-1β 分泌，可促進骨髓細胞表觀遺傳重編程和包括粒細胞/巨噬細胞祖細胞在內的造血干細胞大量擴增，從而驅動訓練免疫［24］。因此，抑制NLRP3炎性體或IL-1β 及其誘導的訓練免疫，可能是治療AS 或減輕其影響的一個有吸引力的靶點［1，24，35］。與 IL-1β 相比，IL-1α在促進固有免疫與增加細胞代謝壓力方面具有更重要的作用，易于誘導AS 無菌性炎癥，提示IL-1α作為AS的治療靶點值得進一步研究［22，36-37］。

3 AS的訓練免疫機制

3.1 表觀遺傳調控 表觀遺傳調控是指獨立于DNA 序列基因轉錄的調控，發(fā)生在DNA 和組蛋白修飾水平，也可以涉及RNA 的調節(jié)［31］。表觀遺傳變化控制組織和DNA 編碼信息的特定表達，它們共同設置“組蛋白代碼”，以控制選定轉錄因子的相互作用和功能［38］。在染色質結構水平上的表觀遺傳重編程作為訓練免疫的核心機制，參與AS 形成過程中的重要環(huán)節(jié)。

3.1.1 單核/巨噬細胞中表觀遺傳的變化 表觀遺傳機制可以調控單核細胞向巨噬細胞分化、極化和活化過程，也可以控制單核細胞和巨噬細胞對全身和局部炎癥刺激（如脂質、細胞因子、DAMPs等）的直接反應［31，39-40］。全表觀基因組分析顯示，體外單核細胞向巨噬細胞分化過程中5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）丟失［41］。盡管 DNA 甲基化與基因組調控有密切聯系，但人們對DNA 甲基化在固有免疫記憶中的潛在作用知之甚少。最近報道m(xù)iRNA 和lncRNA 在建立和維持訓練免疫表觀遺傳修飾方面也具有重要作用［42-44］。然而，目前研究最為深入的是組蛋白修飾對訓練免疫的影響。

組蛋白乙?；泻唾嚢彼釟埢恼姾?，刺激轉錄因子的結合，從而激活基因轉錄［4，6］。研究發(fā)現在促AS 溶血磷脂酰膽堿激活的人主動脈內皮細胞中編碼訓練免疫酶的基因組區(qū)域，組蛋白H3第14位賴氨酸乙酰化（H3K14ac）水平升高［45］。與組蛋白乙酰化相比，組蛋白甲基化對基因轉錄或抑制的作用更為復雜，且具有特異性［4，6］。組蛋白甲基化水平的表觀遺傳重編程對于ox-LDL 體外誘導人單核細胞的訓練免疫是至關重要的，其特征是促炎細胞因子和趨化因子的啟動子上富集的組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化（H3K4me3），逆轉組蛋白的甲基化使ox-LDL 誘導的訓練免疫表型完全消失［1，31］。此外，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）可以誘導訓練免疫，隨后在脂多糖刺激下，增加TNF-α 生成，這個過程依賴于絲裂原激活蛋白激酶、ERK1 和 ERK2［1，46］。針對GM-CSF 的抗體可能發(fā)揮抑制訓練免疫的作用［1，47］。

3.1.2 表觀遺傳酶的影響 組蛋白修飾是可逆的，因此可以通過藥理學靶向調節(jié)表觀遺傳酶的活性，起到相應治療目的［40］。組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）調節(jié)染色質的乙?；癄顟B(tài)，在巨噬細胞促炎和抗炎表型的轉化過程中發(fā)揮不同的功能。HDAC3 是AS 中巨噬細胞表型的主要調節(jié)因子，小鼠骨髓特異性刪除HDAC3 使巨噬細胞獲得抗炎和促纖維化特征，穩(wěn)定AS 斑塊［48］。且在這些巨噬細胞中，IL-4 和轉化生長因子β 信號通路受到抑制［48-49］。HDAC3 促進巨噬細胞向 M1 表型極化，缺乏HDAC3則誘導巨噬細胞M2型極化［9，38］。 此 外 ，HDAC9 也與增加載脂蛋白E 敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠 AS 病變大小相關［50］。在LDLR-/-小鼠模型中，全身和骨髓缺失HDAC9 與限制AS有關。巨噬細胞缺失HDAC9減少促炎基因表達，增加ABCA1、ABCG1 和過氧化物酶體增殖激活受體γ 等活性轉運蛋白表達，增強膽固醇外排，減少泡沫細胞形成［51］。相比之下，HDAC4 可以在小鼠 DC 分化過程中，誘導IL-4 信號通路中精氨酸酶1 表達，從而起到抗炎性極化的作用［52］。綜上所述，這些發(fā)現表明藥物靶向或細胞特異性干預HDACs 可以抑制AS炎癥反應。

調控組蛋白甲基化的表觀遺傳酶對于巨噬細胞炎癥也具有重要影響。研究發(fā)現阻斷特定的H3K27組蛋白去甲基化酶——含Jumonji 結構域蛋白3（Jumonji domain-containing protein 3，JMJD3），可以抑制巨噬細胞的激活以及炎癥細胞因子產生［53］。組蛋白甲基轉移酶抑制劑5'-脫氧-5'-甲基硫代腺苷（5'-deoxy-5'-methylthioadenosine，MTA）預處理單核細胞可使 ox-LDL 衍生的細胞重編程失效［9］。TNF-α 誘導核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因表達，需要混合譜系白血病蛋白1（mixed-lineage leukaemia protein 1，MLL1；具有組蛋白甲基轉移酶活性）向組蛋白H3K4 中添加甲基基團［54］。組蛋白甲基轉移酶——含 SET 和 MYND 結構域蛋白 5（SET and MYND domain-containing protein 5，SMYD5）在 NF-κB 靶基因中維持抑制標記H4K20me3，受到刺激時這些抑制機制被消除，進而誘導啟動子和增強子中激活表觀遺傳標記的積累［55-56］?？傊?，組蛋白甲基轉移酶可以調控巨噬細胞炎癥，其在訓練免疫中的作用值得進一步研究。

此外，10-11 易位（ten-eleven translocation，TET）甲基胞嘧啶雙加氧酶作為關鍵的DNA 去甲基化酶，也可通過與核染色質修飾酶相互作用，促進組蛋白的修飾［44］。例如，TET2 招募 HDAC2，通過組蛋白去乙?；种拼傺谆騃L-6轉錄［57］。巨噬細胞內TET2缺失，使IL-1β基因啟動子組蛋白 H3 乙酰化增加［58］。最近多項證據表明TET2 具有抗AS 和保護血管作用［4，35］。其中，TET2 不僅在血管平滑肌細胞和內皮細胞中發(fā)揮作用，而且影響單核/巨噬細胞分化、極化、表達炎癥基因等多個方面［4］。值得注意的是，Fuster 等［58］發(fā)現在LDLR-/-小鼠模型中TET2基因缺失，導致巨噬細胞中NLRP3 炎性體介導的IL-1β分泌增多。TET2突變促進造血干細胞和干細胞衍生單核細胞的增殖，且AS 斑塊面積顯著增加［58-60］。因此探索造血細胞克隆是否會誘導訓練免疫非常有意義［6］。

3.2 免疫代謝的調控 細胞內代謝改變引起表觀遺傳重編程，可誘導訓練免疫表型，促進炎癥反應。斑塊微環(huán)境中DAMPs、修飾的脂蛋白、缺氧等因素驅動單核/巨噬細胞的代謝和功能重組。細胞內糖酵解的激活、戊糖磷酸途徑、脂肪酸合成、脂肪酸氧化的減少伴隨著脂質溶酶體處理的復雜變化，似乎都有助于AS 的發(fā)生，這些過程也推動了訓練免疫的發(fā)展［61］。利用巨噬細胞代謝的可塑性平衡炎癥反應，恢復AS中保護性免疫功能，是目前研究的熱點［23］。

巨噬細胞中葡萄糖、膽固醇、脂肪酸和氨基酸代謝重編程在AS 過程中促進炎癥反應［62］。研究發(fā)現葡萄糖代謝和氧化反應不僅滿足巨噬細胞活化所需能量，而且與細胞免疫代謝反應有關。葡萄糖代謝從氧化磷酸化轉變?yōu)橛醒跆墙徒狻⒐劝滨０反x增加、膽固醇合成等過程在免疫信號誘導的細胞代謝重組中起著至關重要的作用［63］。不同的代謝途徑滿足不同巨噬細胞表型的能量代謝需求。M1 型巨噬細胞很大程度上依賴糖酵解，其特征是線粒體氧化磷酸化受損以及TCA 循環(huán)的合成代謝再利用［63-64］。此外，丙酮酸通過缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF1）依賴的途徑發(fā)酵成乳酸，而不是進入TCA 循環(huán)，最終為氧化磷酸化提供能量［64］。M2 型巨噬細胞依賴于氧化磷酸化進行代謝，且增加脂肪酸攝取，促進β 氧化［63］。兩種不同的亞型顯示出氨基酸代謝和脂肪酸合成與利用的差異［64］。

訓練免疫過程中伴隨細胞內代謝通路的深度重組，包括糖酵解、氧化磷酸化、谷氨酰胺分解和膽固醇合成。例如，β-葡聚糖刺激單核細胞后，激活組蛋白H3K3me3 和H3K27ac 修飾在幾個關鍵糖酵解酶的啟動子上富集［61］。訓練的巨噬細胞代謝重組導致琥珀酸和富馬酸顯著升高［64］。富馬酸鹽刺激可形成一種類似于β-葡聚糖誘導的訓練免疫的表觀遺傳程序。由于谷氨酰胺補充的TCA 循環(huán)，富馬酸的積累整合免疫和代謝回路，通過抑制賴氨酸特異性去甲基化酶5（lysine-specific demethylase 5，KDM5）誘導單核細胞表觀遺傳重編程［61-62］?？傊?，訓練后的單核細胞和巨噬細胞的代謝變化是訓練免疫表型的重要組成部分，且代謝和表觀遺傳變化之間具有緊密聯系［3］。代謝物濃度的波動調節(jié)表觀遺傳基因組，干預染色質動力學，從而影響基因的持續(xù)表達。許多研究發(fā)現，消耗表觀遺傳反應中代謝產物的酶，可以整合代謝信息和控制轉錄［64］。

在訓練免疫的單核細胞中另一個重要的代謝事件是TCA 循環(huán)的合成代謝再利用，從檸檬酸鹽和乙酰輔酶A 合成膽固醇和磷脂，甲羥戊酸的合成在這一過程中起著核心作用［1］。激活膽固醇合成途徑，而不是膽固醇本身，對骨髓細胞的訓練免疫必不可少［65］。甲羥戊酸鹽作為膽固醇生物合成途徑的第一個代謝產物，它在細胞內的積累，可以通過激活胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）和 mTOR 誘導單核細胞訓練免疫［4，29，65］。他汀類藥物阻斷甲羥戊酸生成能夠阻止訓練免疫表型，此外，用雷帕霉素抑制mTOR 和用MTA 抑制組蛋白甲基化，也可防止甲羥戊酸誘導的訓練免疫，表明訓練免疫中代謝和表觀遺傳控制之間存在微妙平衡［1，4］。膽固醇生物合成和（或）甲羥戊酸，是成熟髓系細胞或造血祖細胞先天性免疫訓練的重要調停者。在訓練免疫期間，膽固醇依賴性免疫代謝串擾也可能與血脂異?；蚋吣懝檀佳Y相關的造血功能變化密切相關，后者可導致AS 過程中骨髓生成增強［59］。進一步明確膽固醇合成對于訓練免疫的影響，對于了解代謝重組在AS 中的作用具有一定意義。

4 結語與展望

訓練免疫是先天宿主防御機制的重要特征，提示固有免疫細胞存在免疫記憶，表觀遺傳和代謝重編程是其中的核心機制。在AS過程中，單核/巨噬細胞受到ox-LDL 刺激可通過細胞代謝和表觀遺傳重組，誘導長期的促炎表型，加速疾病進程，說明AS 作為一種慢性炎癥性疾病與訓練免疫關系密切，靶向干預訓練免疫相關機制可能是恢復AS 免疫穩(wěn)態(tài)的可行策略。例如:（1）探索訓練免疫過程中單核/巨噬細胞分化所涉及的相關機制，并進行藥理學干預；（2）針對單核/巨噬細胞接受刺激后表觀遺傳變化相關機制進行靶向干預，包括改變表觀遺傳酶的活性調節(jié)組蛋白及DNA 修飾、或通過改變非編碼RNA 水平調整相關基因表達；（3）調整單核/巨噬細胞訓練免疫過程中細胞的代謝情況，如糖酵解、氧化磷酸化、谷氨酰胺分解、膽固醇合成等；（4）靶向干預ox-LDL或高脂飲食刺激誘導單核/巨噬細胞表觀遺傳和代謝改變涉及的分子通路；（5）抑制NLRP3炎性體活化及IL-1β 生成；（6）尋找AS 過程中新的訓練免疫細胞亞群及抗原刺激物，開發(fā)針對不同亞群或刺激物的治療方法。最后需要明確的是，雖然干預訓練免疫為AS 在內的免疫相關疾病提供了新的診療策略，但同時需注意監(jiān)測機體感染風險。