朱 聰,畢 衡

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明650000;2.云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明650000)

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)是血液在深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)為血栓引起的靜脈回流障礙性疾病。若血栓脫落則可引起肺動(dòng)脈栓塞(pulmonary embolism,PE),DVT與PE統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE),是同種疾病在不同階段的表現(xiàn),多見于近期有嚴(yán)重創(chuàng)傷或大手術(shù)后、肢體制動(dòng)或腫瘤患者[1]。影響DVT的三大因素為靜脈壁損傷、靜脈血流滯緩和血液高凝狀態(tài)[2]。由于醫(yī)學(xué)倫理的關(guān)系,該項(xiàng)研究?jī)H在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中開展,因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用兔、犬、大鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備具有針對(duì)性的DVT模型,雖然其研究各有側(cè)重,但都未曾脫離對(duì)上述DVT因素的基礎(chǔ)研究。本文對(duì)近年來關(guān)于DVT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性研究進(jìn)行綜述,以便為臨床科研工作者提供參考。

1 靜脈壁損傷的研究進(jìn)展

靜脈壁由外膜、中層和內(nèi)膜組成。當(dāng)內(nèi)膜損傷時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞缺損、脫落,此時(shí)機(jī)體局部血細(xì)胞聚集、血小板黏附,最終形成血栓。通過了解DVT與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相互關(guān)系,建立相對(duì)應(yīng)的靜脈內(nèi)膜損傷后血栓動(dòng)物模型,以此研究針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的輔助藥物,并分析其特異性代謝方式,是目前靜脈壁損傷的主要研究模式。

王兵等[3]將120只新西蘭大白兔隨機(jī)分為創(chuàng)傷固定組、骨折固定組、單純固定組及空白對(duì)照組,光學(xué)顯微鏡下觀察不同時(shí)相點(diǎn)白兔股靜脈血栓形成及靜脈壁損傷情況,結(jié)果顯示,第7日創(chuàng)傷固定組血栓發(fā)生率為80%,伴有靜脈內(nèi)膜損傷、內(nèi)皮細(xì)胞剝脫,發(fā)現(xiàn)白兔創(chuàng)傷性DVT與靜脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)。司春強(qiáng)[4]將55只家兔隨機(jī)分為正常組5只,血栓組、假手術(shù)組各25只,于實(shí)驗(yàn)后半日及1、2、4、7 d取實(shí)驗(yàn)段血管,采用透射電子顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)在家兔急性DVT后的1～2 d內(nèi),內(nèi)皮細(xì)胞凋亡達(dá)到峰值,然后呈下降趨勢(shì),借此反向證實(shí)DVT與靜脈壁的關(guān)系。范春芝等[5]在此基礎(chǔ)上,選取24只雄性比格犬,以比格犬左下肢股靜脈為對(duì)照側(cè),右下肢股靜脈為實(shí)驗(yàn)側(cè),采用二維超聲心動(dòng)圖測(cè)量靜脈管腔直徑與彩色多普勒超聲定位相結(jié)合,在超聲引導(dǎo)下,通過毛刷破壞靜脈內(nèi)膜的方式成功構(gòu)建了比格犬下肢DVT的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?該法操作簡(jiǎn)易、創(chuàng)傷低、血栓形成率較高。在動(dòng)物模型飛速發(fā)展的背景下,王護(hù)國(guó)等[6]將96只大鼠制備成急性DVT模型后,按血栓形成的階段分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期,每期再均分為小劑量組[尿激酶2萬U/(kg·d)]、中劑量組[尿激酶4萬 U/(kg·d)]、大劑量組[尿激酶8萬U/(kg·d)]和模型組,實(shí)驗(yàn)中連續(xù)7 d每日于大鼠尾靜脈注射尿激酶,通過HE、苦味酸-天狼猩紅染色觀察各組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和膠原含量的改變,發(fā)現(xiàn)在血栓形成14 d內(nèi),尿激酶保護(hù)受累血管的內(nèi)皮細(xì)胞而抑制膠原增生,在血栓形成14 d后,尿激酶對(duì)受累血管的內(nèi)皮細(xì)胞無保護(hù)而對(duì)膠原增生仍有抑制作用,這給DVT的治療提供了有效的參考依據(jù)。有學(xué)者證明了DVT的代謝失調(diào)主要集中在能量代謝、鞘脂和腺苷代謝[7],說明小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠨VT特異性代謝產(chǎn)物的特征,為針對(duì)靜脈壁的DVT提供了新的研究方向。

2 靜脈血流滯緩的研究進(jìn)展

血流是針對(duì)血管內(nèi)血液的流動(dòng)而言,其動(dòng)力是心臟搏動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的壓力,當(dāng)血流量受到血管系統(tǒng)的阻力、血液量等各種因素的影響,均可導(dǎo)致血流緩滯,進(jìn)而導(dǎo)致血栓的形成。針對(duì)靜脈血流淤滯這一特征,研究人員通過對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的研究并分析其變化的影響因素,建立了新的動(dòng)物DVT模型。

SHIFRI E C等[8]最早提出了DVT中緩慢與急性股靜脈阻塞的血流動(dòng)力學(xué)理念,實(shí)驗(yàn)中通過使用一個(gè)緩慢和漸進(jìn)的股靜脈阻塞模型,發(fā)現(xiàn)DVT存在血流動(dòng)力學(xué)作為基礎(chǔ)的可能性。為了進(jìn)一步研究并觀測(cè)血流變化,韓力群等[9]建立了犬DVT的動(dòng)物模型,并用彩色多普勒超聲連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血栓形成早期的超聲動(dòng)態(tài)聲像圖及血流動(dòng)力學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)通過超聲動(dòng)態(tài)聲像圖對(duì)犬DVT形成進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,有助于觀察DVT的全過程,特別是對(duì)DVT早期的聲像圖特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。張朝順等[10]將144只大鼠隨機(jī)分為S(假手術(shù))組、N(正常對(duì)照)組、V1(不完全阻滯左股靜脈血流)組、V2(V1＋左下肢制動(dòng))組、V3(V1＋注入10%高滲鹽水1 m L)組、V4(V1＋注入凝血酶0.25 U)組,每組24只,通過比較各組血栓形成情況,分析病理學(xué)方面的差異,并通過病理檢查監(jiān)測(cè)血栓不同時(shí)期的變化及血管再通情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過V3組的方法,可以建立符合臨床研究的DVT大鼠模型,這為DVT的病理轉(zhuǎn)歸及防治研究提供了新的可能。

3 血液高凝狀態(tài)的研究進(jìn)展

血液由血漿和血細(xì)胞構(gòu)成,血細(xì)胞中血小板在體內(nèi)主要發(fā)揮止血功能,對(duì)膠原纖維有著較強(qiáng)的親和力。當(dāng)內(nèi)膜損傷后,血小板迅速黏附聚集于損傷部位,同時(shí)釋放凝血因子,使血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài),為血栓形成提供了可能。因此,可通過對(duì)多種DVT模型的血栓觀察,制定出具有針對(duì)性的血栓參考指標(biāo),并對(duì)其血栓彈性進(jìn)行分析。

白云城等[11]采用狹窄法,將48只雌性大鼠制備成下腔靜脈血栓模型,研究發(fā)現(xiàn)造模后2 h有血栓開始形成,為典型的紅白、白色兩種血栓形態(tài),其中紅色血栓以紅細(xì)胞為主,位于遠(yuǎn)心端,白色血栓以血小板和纖維素為主,位于近心端,形成了對(duì)血栓形態(tài)的初步認(rèn)知。吳鵬等[12]用結(jié)扎法,將30只大鼠下腔靜脈及其分支阻斷,并用微血管夾損傷靜脈壁以誘導(dǎo)DVT,于手術(shù)前第1日和手術(shù)后第1、4、7、10、14、21日采靜脈血檢測(cè),研究發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原、D-二聚體及凝血酶原時(shí)間可作為血栓形成的重要參考指標(biāo)。YU F T H等[13]選用12只新西蘭大白兔隨機(jī)分為高聚集組和對(duì)照組,觀察左、右股靜脈腔內(nèi)面積縮小后的急性反應(yīng)及內(nèi)皮損傷情況,每組其他5只僅在左股靜脈上接受血管狹窄和內(nèi)皮損傷,對(duì)側(cè)右股靜脈作為聚集測(cè)量的配對(duì)對(duì)照,通過以上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),紅細(xì)胞聚集的顯著增加促進(jìn)了大白兔股靜脈血栓形成,證實(shí)了局部血流動(dòng)力學(xué)改變?cè)贒VT發(fā)病中的病理生理作用。劉曉娜等[14]采用單側(cè)靜脈狹窄法,將15只日本大耳白兔制備成下腔靜脈血栓模型,分別于血栓形成后第5、14日,在超聲剪切波彈性成像技術(shù)輔助下,檢測(cè)下腔靜脈血栓頭(近心端)、體、尾(遠(yuǎn)心端)部的楊氏模量值,并于測(cè)量后處死大耳白兔,再將完整的下腔靜脈血栓取出,并制備成病理切片觀察,發(fā)現(xiàn)超聲剪切波成像技術(shù)下血栓彈性存在明顯異質(zhì)性,這對(duì)于DVT下血栓彈性的研究提供了新的認(rèn)知空間。

4 小結(jié)

1970年,就有學(xué)者將創(chuàng)傷研究的模型分為人體、人類學(xué)、活體動(dòng)物和非物理模型4類[15],而活體動(dòng)物模型在當(dāng)今醫(yī)學(xué)界應(yīng)用最廣,與此同時(shí),由于理想的動(dòng)物血栓模型并不存在,動(dòng)物不會(huì)自發(fā)性的出現(xiàn)靜脈血栓癥[16],因此在DVT實(shí)驗(yàn)中就選擇了與人類基因較為密切的活體動(dòng)物如兔、大鼠、小鼠等,作為研究對(duì)象。雖然均存在大小、結(jié)構(gòu)等的差異,但因其廉價(jià)、身體新陳代謝快,手術(shù)操作性強(qiáng),能夠滿足學(xué)者模擬相關(guān)臨床環(huán)境的需求,被用于造模等。

近年來,高齡、肥胖、靜脈曲張、重度吸煙等人群明顯增多,成為靜脈血栓癥形成的高危因素,這些危險(xiǎn)因素相互疊加、相互影響,以致在近期有大手術(shù)或嚴(yán)重創(chuàng)傷后、長(zhǎng)期臥床、肢體制動(dòng)等可能引起血流滯緩的情況下,導(dǎo)致血管內(nèi)皮缺氧、血液高凝、氧化應(yīng)激,從而促使DVT的發(fā)生[17]。因此,DVT的三大因素并不是獨(dú)立存在的,通常有著連鎖效應(yīng),具有針對(duì)性的損傷造模尤為重要。目前國(guó)內(nèi)見諸報(bào)道的造模方式主要有結(jié)扎法[12]、狹窄法[11,14]、氯化鐵法[18]、血栓誘導(dǎo)劑干預(yù)法[9]等,都能建立可靠有效的DVT動(dòng)物模型,同時(shí)測(cè)量血栓的重量、大小及組織學(xué)評(píng)估、影像技術(shù)的發(fā)展(如CT、核磁共振、高頻超聲)為動(dòng)物模型的血栓測(cè)定提供了更加全面多樣的選擇途徑[19]。近年來也有學(xué)者提出新的血栓形成三要素:血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的活化、血小板黏附聚集和血漿中可溶性凝血因子的激活[20];通過無創(chuàng)操作檢測(cè)D-二聚體濃度與創(chuàng)傷患者的深靜脈血栓形成的相關(guān)性,具有一定的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值[21];通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入DVT模型的制備,研究其發(fā)病機(jī)制也是重要的研究途徑[22]。隨著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選材的多樣性,動(dòng)物研究能夠從宏觀到微觀、從病因到病程、從治療到診斷,充分體現(xiàn)著制備DVT動(dòng)物模型的重要性,也為臨床進(jìn)行早期干預(yù)治療提供最佳時(shí)機(jī)、減少并發(fā)癥、改善患者預(yù)后提供了重要參考。