湯云飛，蘇晨，高學軍，崔英俊

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150030）

0 引 言

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP9）是一種鋅依賴性酶[1]，是MMP蛋白家族的成員。MMP家族在組織重塑，器官發(fā)育[2]，癌細胞增殖及遷移[3-4]，降解細胞外基質(zhì)[5]、控制細胞生長[6]、炎癥或血管生成[7]等生理過程中發(fā)揮至關重要的作用。正常乳腺發(fā)育的不同階段需要細胞外基質(zhì)精細控制的降解和重塑，MMP9被認為是其中的關鍵酶[8]。MMP9在影響乳腺結構的同時，對乳腺泌乳是否有影響還未見報道。

本研究利用MMP9過表達載體或干擾片段轉染奶牛乳腺上皮細胞，然后分別檢測奶牛乳腺上皮細胞的β-酪蛋白表達、乳脂含量，以及細胞增殖情況。旨在通過本實驗確認MMP9是否影響奶牛乳腺上皮細胞泌乳。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室保存的奶牛乳腺上皮細胞，MMP9過表達質(zhì)粒（p-31質(zhì)粒，博仕公司），MMP9干擾片段（蘇州吉瑪），甘油三酯試劑盒（普利萊e1013），MTT試劑盒（碧云天c0009），Lipofectamine 2000（Invitrogen），組織RNA微量提取試劑盒（美吉，R 4114-02），TB Green試劑盒（Takara，rr820a），Abi7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems），DU 640紫外分光光度計（Beckman）。

1.2 研究方法

1.2.1 轉染

將奶牛乳腺上皮細胞傳至6孔板。過表達實驗設對照組、過表達陰性對照組（加pcDNA3.1空質(zhì)粒）、MMP9過表達組（加MMP9過表達載體）三組；抑制實驗設對照組、抑制陰性對照組（加入干擾片段陰性對照）、MMP9抑制組（加MMP9干擾片段）三組。在細胞長至70%左右時按照以上分組進行轉染，24 h后收集各組樣品。

1.2.2 熒光定量PCR

用RNA提取試劑盒提取mRNA后，進行反轉錄。按照TB Green試劑盒說明書在冰盒上配制20 uL體系反應液，使用兩步法進行熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）。MMP9引物（5’-3’GGTGCTGGCTTGCTGCTCTG，TTGGTGAGGTTGGTTCGTGGTTC）、β-酪蛋白引物（5’-3’ACCAGCCTCACCAGCCTCTTC，CCGGACAGGACCGAGTACAGG）引物、β-actin引物（5‘-3’TGTTAGCTGCGTTACACCCT，CTGTCACCTTC ACCGTTCC）（生工公司）。

1.2.3 甘油三酯檢測

按照甘油三酯試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖

將奶牛乳腺上皮細胞傳至96孔板，每孔加入1 000個細胞[9]。在各組分別進行轉染后，按照MTT細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS21.0和GraphPad Prism7.0對所有數(shù)據(jù)進行方差分析和作圖，結果以平均數(shù)（X）±標準誤表示。每個實驗進行3次重復。

2結 果

2.1 MMP9檢測及MMP9對奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白表達的影響

MMP9過表達載體轉染奶牛乳腺上皮細胞24 h后，qPCR結果表明，MMP9過表達組奶牛乳腺上皮細胞的MMP9 mRNA表達顯著高于對照組和過表達陰性對照組（圖1）；MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細胞的MMP9 mRNA表達顯著低于對照組和抑制陰性對照組（圖2）。

圖1 MMP9過表達時奶牛乳腺上皮細胞的MMP9 mRNA表達

qPCR結果還表明，MMP9過表達組奶牛乳腺上皮細胞的β-酪蛋白mRNA表達顯著高于對照組和過表達陰性對照組（圖3）；MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細胞的β-酪蛋白mRNA表達顯著低于對照組和抑制陰性對照組（圖4）。

圖2 MMP9抑制時奶牛乳腺上皮細胞的MMP9 mRNA表達

圖3 MMP9過表達時奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的mRNA表達

圖4 MMP9抑制時奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的mRNA表達

2.2 MMP9對奶牛乳腺上皮細胞乳脂含量的影響

甘油三酯檢測結果表明，MMP9過表達組奶牛乳腺上皮細胞的甘油三酯含量顯著高于對照組和過表達陰性對照組（圖5）；MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細胞的甘油三酯含量顯著低于對照組和抑制陰性對照組（圖6）。

圖5 MMP9過表達時奶牛乳腺上皮細胞的乳脂含量

圖6 MMP9抑制時奶牛乳腺上皮細胞的乳脂含量

圖7 MMP9過表達時奶牛乳腺上皮細胞的細胞增殖

圖8 MMP9抑制時奶牛乳腺上皮細胞的細胞增殖

2.3 MMP9對奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響

MTT法檢測結果表明，在各檢測時點，MMP9過表達組奶牛乳腺上皮細胞的細胞增殖均顯著高于對照組和過表達陰性對照組（圖7）；在各檢測時點，MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細胞的細胞增殖均顯著低于對照組和抑制陰性對照組（圖8）。

3討 論

MMP家族成員都是細胞外基質(zhì)蛋白[10]。MMP9廣泛合成和分泌于不同細胞，是一種多功能蛋白，在乳腺中有較高表達[2]。以往對乳腺中MMP9的研究表明它與乳腺發(fā)育中的結構變化有關，但近年在奶山羊乳腺上皮細胞及MCF-7細胞中的研究表明，當MMP9活性受到抑制時會影響B(tài)cl-2表達，從而促進乳腺上皮細胞凋亡，抑制乳腺上皮細胞增殖[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)MMP9與細胞存活有關，能促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，但這一過程涉及到的分子機制仍需進一步研究。

哺乳動物的泌乳速率取決于乳腺上皮細胞的數(shù)量和活性。在大鼠泌乳高峰中，75%泌乳的提升來自于新增殖的乳腺上皮細胞[13]。本研究對MMP9過表達或表達受抑制時的奶牛乳腺上皮細胞泌乳情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)MMP9能提高奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白表達和甘油三酯含量，表明MMP9能促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳。推測這與MMP9能促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，提高奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)量和活性有關。