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        QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑

        2020-01-13 07:22:22楊明伊鋆胡筱靜董秋花許晴李首道盧躍鵬江小明涂鳳琴
        中國(guó)乳品工業(yè) 2019年11期
        關(guān)鍵詞:激動(dòng)劑奶粉乙腈

        楊明,伊鋆,胡筱靜,董秋花,許晴,李首道,盧躍鵬,江小明,涂鳳琴

        (武漢食品化妝品檢驗(yàn)所武漢430012)

        0 引言

        β-受體激動(dòng)劑屬于腎上腺類合成藥物,它具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)[1-2],對(duì)支氣管哮喘、痙攣和高血壓等癥狀均有較好的效果。其能夠擴(kuò)張平滑肌,進(jìn)而提高肺活量,同時(shí)也可以調(diào)控胰島素從而加速分解體內(nèi)糖類和脂類。然而在動(dòng)物飼料中添加此類藥物,可以明顯提升動(dòng)物的廋肉率。但是食品中殘留的瘦肉精會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害,會(huì)出現(xiàn)中毒、引發(fā)惡性腫瘤,甚至是導(dǎo)致死亡等[3-4]。在2002年,我國(guó)已將β-受體激動(dòng)劑列入《食用動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》[5],然而在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,依然存在β-受體激動(dòng)劑非法濫用的情況。嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒生長(zhǎng)期不可或缺的營(yíng)養(yǎng)食品,其β-受體激動(dòng)劑殘留將會(huì)給嬰幼兒的正常發(fā)育和健康成長(zhǎng)帶來巨大的傷害。因此,建立嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑分析方法對(duì)于監(jiān)控嬰幼兒配方奶粉中β-受體激動(dòng)劑殘留情況,以保障嬰幼兒食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        目前動(dòng)物源食品中β-受體激動(dòng)劑類藥物的測(cè)定方法主要有毛細(xì)管電泳法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[7]、液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[10]等。毛細(xì)管電泳法操作簡(jiǎn)便,但分離能力較弱,穩(wěn)定性差,重現(xiàn)性不好。酶聯(lián)免疫吸附法快速簡(jiǎn)單,但易出現(xiàn)假陽(yáng)性。GC-MS法通常需要衍生化處理,操作繁瑣。HPLC法分離效果較好,但是定性能力和特異性較差;HPLC法定性能力較弱,特異性較差;HPLC-MS/MS法具有高靈敏度、高選擇性和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn),已在動(dòng)物源類食品分析中得到廣泛的應(yīng)用。在前處理技術(shù)方面,傳統(tǒng)的前處理技術(shù)存在有機(jī)溶劑使用量大、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)技術(shù)其具有操作簡(jiǎn)單、便捷高效、溶劑用量小等特點(diǎn),近年來在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-12]。目前關(guān)于嬰幼兒配方奶粉中β-受體激動(dòng)劑測(cè)定的方法少見報(bào)道。本研究結(jié)合了QuECh-ERS技術(shù)的操作快速簡(jiǎn)便和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn),建立了QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(QuEChERS-HPLC-MS/MS)同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留的分析方法。方法操作簡(jiǎn)便、分析速度快、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好,能夠?yàn)閶胗變号浞侥谭壑?4種β-受體激動(dòng)劑殘留狀況的監(jiān)測(cè)提供有力的技術(shù)支撐。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 儀器與試劑

        SCIEX4500TripleQuad質(zhì)譜儀(配有可用于電噴霧電離的TurboV離子源),美國(guó)ABSCIEX公司;LC30A液相色譜儀,日本島津公司;AllegraX-15R Centrifuge離心機(jī),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司;Vortex-Genie2渦旋振蕩器,美國(guó)ScientificIndustries公司;PM5-2000TL超聲波清洗器,普律瑪儀器公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司;ME204/02電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,英國(guó)Genevac公司。

        克倫特羅(CAS:37148-27-9)、沙丁胺醇(CAS:18559-94-9)、萊克多巴胺(CAS:90274-24-1)、特布特林(CAS:23031-32-5)、西馬特羅(CAS:54239-37-1)、噴 布 特 羅(CAS:38363-32-5)、妥 布 特 羅(CAS:41570-61-0)、馬布特羅(CAS:54240-36-7)、馬噴特羅(CAS:95656-68-1)、溴氯布特羅(CAS:37153-52-9)、溴布特羅(CAS:41937-02-4)、羥甲基克倫特羅(CAS:

        37162-89-3)、塞布特羅(CAS:54239-37-1)、鹽酸苯氧丙酚胺(CAS:579-56-6)均為FirstStandard品牌標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥97.0%),天津阿爾塔科技有限公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸銨(均為色譜純),德國(guó)Merck公司;甲酸、氨水(均為色譜純),美國(guó)Sigma-Aldrich公司;十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)吸附劑、中性氧化鋁(Al2O3-N)、弗羅里硅土(Florisil)和氧化鋯(Zirconia),上海安譜科學(xué)儀器公司;乙酸銨、氯化鈉(NaCl)、硫酸鎂(MgSO4)和硫酸鈉(Na2SO4),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水(18.2MΩ·cm)由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

        1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        分別準(zhǔn)確稱取適量14種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解,配制質(zhì)量濃度約為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18°C保存。臨用時(shí)用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3 樣品前處理

        嬰幼兒配方奶粉充分混勻,準(zhǔn)確稱取1g(精確至0.0001)試樣置于50mL具塞塑料離心管中,加入5.0mL2mol/L乙酸銨緩沖液,50μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶,渦旋使奶粉充分溶解,37℃酶解12h,然后再加入10mL5.0%氨水乙腈,渦旋混勻,超聲提取30min,加入3gNaCl+3gNa2SO4,渦旋振蕩,以4750r/min冷凍離心5min。取全部上清液置于含100mgPSA吸附劑的15mL具塞離心管中,渦旋振蕩2min,4750r/min離心5min,取5mL上清液于試管中,40℃旋轉(zhuǎn)濃縮至近干,用1.0mL乙腈-0.1%甲酸水(1+9,體積比)復(fù)溶,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,供HPLC-MS/MS測(cè)定。

        1.4 儀器條件

        1.4.1 色譜條件

        色譜柱:WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm);柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5μL;流動(dòng)相A:5mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水;流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫程序:0~1.5min,5.0%B;1.5~4.0min,5.0%~40.0%B;4.0~6.0min,40.0%~90.0%B;6.0~9.0min,90.0%B;9.0~9.01min,90.0%~5.0%B;9.01~12.0min,5.0%B。

        1.4.2 質(zhì)譜條件

        電離源:ESI正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;電噴霧電壓(IS):4500V;霧化氣(GS1):50.0psi;輔助氣流速(GS2):50psi;氣簾氣壓力(CUR):35psi;碰撞氣體(CAD):Medium;離子源溫度(TEM):500℃。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        利用針泵進(jìn)樣將兩種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。分別采用ESI+和ESI-模式對(duì)14種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行母離子全掃描,結(jié)果表明14種β-受體激動(dòng)劑在ESI+和ESI-模式下均有較高的質(zhì)譜響應(yīng),在ESI+模式下信號(hào)穩(wěn)定性較好。因此優(yōu)先選擇ESI+掃描模式,在該模式下兩種化合物均產(chǎn)生[M+H]+的母離子。對(duì)兩種化合物進(jìn)行二級(jí)碎片離子掃描,選擇響應(yīng)較高、干擾小的兩個(gè)碎片離子用于定性定量分析,其中響應(yīng)最高的碎片離子用于定量分析,同時(shí)優(yōu)化各目標(biāo)化合物的去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件如表1所示。

        2.2 色譜條件的優(yōu)化

        本實(shí)驗(yàn)選擇WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)色譜柱對(duì)14種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行分離分析。采用ESI+模式,比較了14種β-受體激動(dòng)劑在乙腈-水與甲醇-水流動(dòng)相體系中的色譜行為,結(jié)果表明,目標(biāo)化合物在乙腈-水流動(dòng)相體系中分離度較好。在流動(dòng)相中加入適量的酸和乙酸銨可以提高分析物的離子響應(yīng)和分離度,從而達(dá)到足夠的靈敏度。因此,本研究進(jìn)一步考察在流動(dòng)相體系中添加不同含量的甲酸、乙酸銨對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明,以5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相時(shí),各目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)高、保留穩(wěn)定且峰形好。因此,本實(shí)驗(yàn)采用5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相。

        表1 14種β-受體激動(dòng)劑的母離子、子離子等重要質(zhì)譜參數(shù)

        2.3 提取試劑優(yōu)化

        14種化合物具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核[13],極性強(qiáng),易溶于乙腈、甲醇和乙酸乙酯等溶劑,本實(shí)驗(yàn)選用乙腈、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑并比較其提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲醇提取液的水分較多且顏色較深,不僅會(huì)干擾目標(biāo)物的分析、損害色譜柱、污染質(zhì)譜離子源;乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重;嬰幼兒配方奶粉中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂類,而乙腈具有很好的沉淀蛋白作用[14],且各化合物的提取回收率均優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑,同時(shí)進(jìn)一步考察比較了添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%氨水的乙腈提取情況,測(cè)定結(jié)果以3次平行測(cè)定的平均值表示。結(jié)果表明:14種目標(biāo)化合物在0.5%、1%、2%三種氨水乙腈提取溶劑中平均回收率相差不大,分別為72.61%、72.14%、71.66%,且略低于3%、4%、6%三種氨水乙腈的平均回收率,分別為77.06%、81.06%、79.87%。相比之下5%氨水乙腈作為提取溶劑時(shí)的平均回收率最高,為93.30%,特別是沙丁胺醇的回收率大大高于其它5種,且各目標(biāo)物的回收率均在80%~110%之間,完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此本實(shí)驗(yàn)采用5%氨水乙腈作為提取溶劑。不同提取溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響如圖1所示。

        圖1 不同提取溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

        2.4 吸附劑的選擇

        嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)中富含蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等多種有機(jī)成分,可能會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定造成干擾。本實(shí)驗(yàn)考察了含量均為100 mg的PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、NH2吸附劑、中性氧化鋁(Al2O3-N)和弗羅里硅土(Florisil)和氧化鋯(Zirconia)等QuECh-ERS方法常用凈化劑對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果和回收率情況,測(cè)定結(jié)果以3次平行測(cè)定的平均值表示。結(jié)果表明(如圖2所示),NH2吸附劑和Al2O3-N作為吸附劑時(shí)各目標(biāo)化合物的平均回收率分別為79.81%和76.61%,均在70%~80%之間;PSA、C18、GCB、Florisil和Zirconia作為吸附劑時(shí)各目標(biāo)化合物平均回收率分別為83.45%、84.72%、85.84%、83.88%和80.35%,均優(yōu)于NH2吸附劑和Al2O3-N,且噴布特羅在PSA吸附劑條件下的回收率為70.93%,而在其它6種吸附劑條件下回收率均低于60%,表明這六種吸附劑對(duì)噴布特羅具有一定程度的吸附。故本實(shí)驗(yàn)最終選用100 mg PSA吸附劑對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

        圖2 不同凈化劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

        2.5 鹽析劑的優(yōu)化

        NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的鹽析劑,嬰幼兒配方奶粉樣品經(jīng)過酶解后的水分含量較高,需要加入合適的鹽析劑使在用5%氨水乙腈提取時(shí)出現(xiàn)有機(jī)相和水相分層,以達(dá)到除水的目的。本實(shí)驗(yàn)考察了6 g NaCl、6 g MgSO4、6 g Na2SO4、3 g NaCl+3 g MgSO4、3 g NaCl+3 g Na2SO4、3 g MgSO4+3 g Na2SO46種鹽析劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響,測(cè)定結(jié)果以3次平行測(cè)定的平均值表示。結(jié)果表明(如圖3所示),Mg-SO4、NaCl+MgSO4、MgSO4+Na2SO4三種鹽析劑分別為52.71%、78.71%、60.85%,各目標(biāo)化合物平均回收率偏低,可能原因是目標(biāo)物與Mg2+發(fā)生螯合反應(yīng);Na2SO4作為鹽析劑時(shí)目標(biāo)化合物的平均回收率為53.14%,完全不滿足實(shí)驗(yàn)要求;而NaCl和NaCl+Na2SO4這兩種作為鹽析劑時(shí)平均回收率分別為83.29%和90.59%,很明顯NaCl+Na2SO4作為鹽析劑時(shí)效果優(yōu)于NaCl。因此,在該實(shí)驗(yàn)中,選擇3 g NaCl+3 g Na2SO4作為鹽析劑。

        圖3 不同鹽析劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

        2.6 基質(zhì)效應(yīng)

        基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect,ME)是指目標(biāo)化合物在離子化時(shí)受到樣品基質(zhì)中的某些組分的干擾而引起的分析信號(hào)變化,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)?;|(zhì)效應(yīng)可通過比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評(píng)價(jià)[15]。計(jì)算公式:ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME為0.85-1.15時(shí),基質(zhì)效應(yīng)不明顯;當(dāng)ME>1.15時(shí),存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)ME<0.85時(shí),存在基質(zhì)抑制效應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)14種β-受體激動(dòng)劑的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,羥甲基克倫特羅(ME=0.84)基質(zhì)效應(yīng)<0.85,存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng),其它13種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在0.85~1.15之間。為使定量分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,故本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作校準(zhǔn)曲線來降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

        2.7 方法學(xué)考察

        用空白基質(zhì)提取液配制系列濃度的14種β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在各優(yōu)化條件下分析測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo)(y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,14種目標(biāo)化合物在0.5~58.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9990。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N)計(jì)算定量限(LOQ),目標(biāo)化合物的檢出限均為0.12~0.52μg/kg,定量限為0.40~1.73μg/kg。選取陰性樣品添加3個(gè)濃度水平(2.0、10.0、40.0μg/kg)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行樣,以考察方法的回收率和精密度。結(jié)果見表2,14種目標(biāo)化合物的平均回收率為70.69%~98.54%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.59%~9.24%,方法回收率高、精密度高,滿足嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑殘留監(jiān)測(cè)的要求。

        表2 分析物的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

        2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

        采用本方法對(duì)從市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的56批次嬰幼兒配方奶粉(28批次Ⅰ段,14批次Ⅱ段,14批次Ⅲ段)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明,所測(cè)嬰幼兒配方奶粉中均未檢出這14種β-受體激動(dòng)劑。

        3 結(jié)論

        本研究以5%氨水乙腈為提取溶劑,采用QuECh-ERS前處理技術(shù),結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件,建立了快速測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑的分析方法。方法簡(jiǎn)單快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏可靠,并成功用于實(shí)際樣品的測(cè)定,可作為嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑的定性定量檢測(cè)手段,對(duì)于嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑殘留情況的監(jiān)測(cè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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