陳錦萍 林鴻悅 曾 楊 黃書榮 吳偉崗

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院胃腸外科，泉州 362000)

胃癌(Gastric cancer,GC)是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，目前仍是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一；因發(fā)病快、早期診斷困難，多數(shù)患者確診時已為轉(zhuǎn)移性胃癌，5年生存率不足30%[1-3]。使用細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行化療雖然對胃癌發(fā)展起到一定的抑制作用，但也帶來較大的副作用，給患者造成巨大的身心痛苦，且在此過程中，胃癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，故綜合效果欠佳[4]。因此，尋找具有抑制胃癌轉(zhuǎn)移能力的活性物質(zhì)非常必要。植物提取物是天然的抗癌藥物，副作用較小，姜黃素(Curcumin,CM)就是從傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中提取得到的多酚類化合物，在亞洲國家作為化妝品、食品添加劑和傳統(tǒng)草藥的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史[5，6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素生物學(xué)活性廣泛，包括降血脂、抗癲癇、抗抑郁、抗癌等[7-10]。近年來，姜黃素的抗腫瘤生物學(xué)活性受到了國內(nèi)外學(xué)者的重視，其機(jī)制主要與改變腫瘤微環(huán)境、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性有關(guān)[11-13]。而姜黃素對胃癌MGC-803細(xì)胞的體內(nèi)外生長和轉(zhuǎn)移作用研究還較少。本文以人胃癌MGC-803細(xì)胞為研究對象，探討黃素對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 姜黃素(純度為98.7 %，批號110823-201706)購自中國食品藥品檢定研究院，使用前用二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)配成母液，-20℃保存；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；DMSO購自Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP生物素缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、結(jié)晶紫染色液、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國Invitriogen公司；放射免疫沉淀法(Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液購自南京碧云天生物技術(shù)公司；Ki67(ab16667)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)(ab92552)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartic protease 3,Caspase-3)(ab32351)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab182858)、波形蛋白(Vimentin)(ab92547)、神經(jīng)鈣黏蛋白(Neural cadherin,N-cadherin)(ab76011)、Snail(ab216347)、上皮鈣黏蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)(ab40772)、β-catenin(ab32572)、T細(xì)胞因子(T cell factor 4,TCF4)(ab217668)、c-Myc(ab32072)和β-actin(ab213262)一抗和二抗(ab150077)均購自英國Abcam公司；溴脫氧核苷尿嘧啶(Bromodeoxyu-ridine,BrdU)和免疫組化試劑盒均購自廣州銳博生物有限公司。

1.1.2儀器 超凈工作臺、低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國Bio-Rad公司；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司；倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.1.3細(xì)胞株 人胃癌MGC-803細(xì)胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。用含有10% 胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行換液，融合率達(dá)到85%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2方法

1.2.1BrdU染色檢測細(xì)胞增殖 接種胃癌MGC-803細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，用含0.4 %FBS的培養(yǎng)液同步化孵育72 h，每組設(shè)3個重復(fù)孔。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別為Control(對照)組、CM(10 μmol/L)組、CM(20 μmol/L)組和DM(40 μmol/L)組[14]，用對應(yīng)終濃度藥液處理24 h，加入終濃度為0.03 μg/ml的BrdU繼續(xù)孵育40 min。磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer,PBS)洗滌細(xì)胞3次，用多聚甲醛固定10 min，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。鏡下觀察并計數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.2克隆形成實驗檢測細(xì)胞存活情況 接種細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)80%，分組方法同1.2.1，加入對應(yīng)終濃度藥物處理24 h。收集各組細(xì)胞，每組取1 000個細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)10 d。用20%乙醇固定克隆后，0.4%結(jié)晶紫染色，鏡下觀察并計算克隆數(shù)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平 接種細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，分組方法同1.2.1，加入對應(yīng)終濃度藥物處理24 h。用胰酶收集各組細(xì)胞，調(diào)整密度至1×106個/ml。嚴(yán)格按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，取100 μl加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI染色液，室溫避光孵育15 min后，上機(jī)檢測。

1.2.4Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力 接種細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)80%，分組方法同1.2.1，加入對應(yīng)終濃度藥物處理24 h。收集各組細(xì)胞，調(diào)整密度至3×105個/ml，接種于提前用Matrigel包被的Transwell小室上層，并加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，在Transwell小室下層加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。結(jié)晶紫染色，鏡下隨機(jī)選取5個視野對染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5劃痕閉合實驗檢測細(xì)胞遷移能力 接種細(xì)胞于12孔板內(nèi)，每孔1×105個，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，用10 μl槍頭作橫線劃痕，PBS清洗去除脫落細(xì)胞。分組方法同1.2.1，加入10 μg/ml終濃度的絲裂霉素C抑制細(xì)胞增殖[15]，同時加入對應(yīng)終濃度藥物處理24 h。鏡下拍照并計算劃痕閉合率。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6異種移植瘤模型建立、小鼠存活率及腫瘤體積測定 5周齡SPF級雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2014-0001。小鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境，溫度26～28℃，濕度50%～60%，光照時間10 h，自由采食飲水，適應(yīng)性3 d后進(jìn)行實驗。將胃癌MGC-803細(xì)胞調(diào)整至2×107ml-1，于小鼠腋下皮下接種0.2 ml。將小鼠隨機(jī)分為Control(對照)組、CM(0.5 mg/kg)組、CM(1 mg/kg)組和CM(2 mg/kg)組[16]，每組5只，分別灌胃生理鹽水、0.5、1和2 mg/kg的CM溶液，每天1次，連續(xù)14 d。每天觀察并記錄小鼠存活情況，每5 d測量一次腫瘤體積，于第30天摘取腫瘤組織保存?zhèn)溆?。體積：V=長×寬2/2。

1.2.7TUNEL檢測腫瘤組織凋亡情況 取1.2.6保存的腫瘤組織，將各組腫瘤組織制作成4 μm厚度的石蠟切片，嚴(yán)格按照TUNEL染色試劑盒操作進(jìn)行腫瘤組織的染色。鏡下隨機(jī)選取5個不同視野，計算每個視野凋亡小體率=凋亡小體數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。

1.2.8免疫組化檢測腫瘤組織內(nèi)Ki67表達(dá)水平 取1.2.6保存的腫瘤組織，將各組腫瘤組織制作成4 μm厚度的石蠟切片，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。Ki67表達(dá)陽性細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒沉著。鏡下隨機(jī)選取5個不同視野，每個視野Ki67陽性率=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。

1.2.9蛋白印跡檢測細(xì)胞增殖、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及通路蛋白的表達(dá) 冰上提取各組胃癌細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測各組蛋白濃度并調(diào)成一致。每組取20 μg蛋白質(zhì)用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，加入Ki67、PCNA、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TCF-4、c-Myc和β-actin一抗(1∶500)，4℃孵育過夜。第二天棄去一抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入對應(yīng)二抗(1∶1 000)，室溫封閉1 h后，滴加電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescent,ECL)液于暗室曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)灰度值，以β-actin灰度值來表示目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1CM抑制MGC-803細(xì)胞增殖 BrdU染色和克隆形成實驗檢測MGC-803細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞克隆數(shù)量降低(P<0.05或P<0.01，圖1A、B)，且呈CM濃度依賴性；Western blot檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細(xì)胞中Ki67和PCNA相對蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01，圖1C)，且呈CM濃度依賴性。

2.2CM促進(jìn)MGC-803細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測MGC-803細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細(xì)胞凋亡增加(P<0.05或P<0.01，圖2A)，且呈CM濃度依賴性；Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細(xì)胞中Caspase-3、Bax相對蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2則增加(P<0.05或P<0.01，圖2B)，且呈CM濃度依賴性。

2.3CM抑制MGC-803細(xì)胞侵襲遷移能力 Transwell實驗和劃痕閉合實驗檢測MGC-803細(xì)胞侵襲遷移能力，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組侵襲細(xì)胞數(shù)量、劃痕閉合率降低(P<0.05或P<0.01，圖3A、B)，且呈CM濃度依賴性；Western blot檢測細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組MGC-803細(xì)胞中Vimentin、N-cadherin和Snail1相對蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin則增加(P<0.05或P<0.01，圖3C)，且呈CM濃度依賴性。

2.4CM抑制MGC-803細(xì)胞通路蛋白表達(dá) Western blot檢測MGC-803細(xì)胞中通路蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明：與對照組相比，CM組MGC-803細(xì)胞中β-catenin、TCF4和c-Myc的相對蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01，圖4)，且呈CM濃度依賴性。

圖1 MGC-803細(xì)胞增殖情況Fig.1 Proliferation of MGC-803 cellsNote:A.Cell proliferation was detected by BrdU;B.Colony formation of MGC-803 cells;C.Protein expression of Ki67 and PCNA were tested by Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

圖2 MGC-803細(xì)胞凋亡檢測Fig.2 Apoptosis detection of MGC-803 cellsNote:A.Apoptosis of MGC-803 cells were detected by flow cytometry;B.Protein expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 were tested by Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

圖3 MGC-803細(xì)胞侵襲遷移能力檢測Fig.3 Invasion and migration ability of MGC-803 cells were detectedNote:A.Cell invasion ability was detected by transwell assay;B.Cell migration ability was detected by scratch closure test;C.Protein expression of Vimentin,N-cadherin,Snail1 and E-cadherin were tested by Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

2.5CM對MGC-803細(xì)胞移植瘤生長及腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 統(tǒng)計各組移植瘤小鼠存活率和移植瘤體積，結(jié)果表明：與對照組相比，CM組小鼠存活率增加，腫瘤體積減小(P<0.05或P<0.01，圖5A、B)，且呈CM濃度依賴性；TUNEL檢測腫瘤組織凋亡水平，結(jié)果表明：與對照組相比，CM組腫瘤組織凋亡率增加(P<0.05或P<0.01，圖5C)，且呈CM濃度依賴性；免疫組化檢測腫瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，CM組腫瘤組織中Ki67陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05或P<0.01，圖5D)，且呈CM濃度依賴性。

圖4 MGC-803細(xì)胞通路蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of signaling pathway protein in MGC-803 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

圖5 CM對移植瘤生長及腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of CM on growth of transplanted tumor and expression of related proteins in tumor tissuesNote:A.Percent survival of transplanted tumor mouse;B.Tumor volumes of each group were measured on day 30;C.Apoptosis level of tumor tissue was detected by TUNEL assay;D.Positive cells of Ki67 were tested by immunohistochemical method.*.P<0.05,**.P<0.01 versus Control group.

3 討論

胃癌是中國第三大最常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一，全球胃癌的死亡率高達(dá)50%[17]。隨著人們生活方式的改變，幽門螺旋桿菌感染、環(huán)境改變等因素導(dǎo)致了胃癌的年輕化趨勢[18]。目前，控制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌治療亟待解決的問題，這將直接決定患者的預(yù)后狀況。中藥因其低毒、高效、來源廣泛、價格較低等優(yōu)點，在近年來的腫瘤治療中表現(xiàn)出應(yīng)用價值[19]。研究表明，姜黃素通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因及多種信號通路對多種腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用，如頸部鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胰腺腺癌等[20-23]。基于此，本文以人胃癌MGC-803細(xì)胞為研究對象，研究姜黃素對體內(nèi)外增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的影響及其可能機(jī)制。

細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和凋亡抵抗是癌癥發(fā)生發(fā)展的兩大特點。Zhang等[24]研究表明，在膀胱癌中，姜黃素抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。Liu等[25]采用CCK-8法和Ki67染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素呈時間和濃度依賴性抑制了胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖能力。Ki67是一種細(xì)胞增殖關(guān)鍵蛋白，可作為癌癥無限增生的標(biāo)志物，而PCNA在DNA復(fù)制、修復(fù)、細(xì)胞周期及凋亡等方面起著重要作用[26，27]。另外，Caspase-3、Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，可影響腫瘤發(fā)展進(jìn)程[28，29]。在本文中，姜黃素劑量依賴性減少胃癌MGC-803細(xì)胞的BrdU陽性率和克隆形成數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕閉合率，增加細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制與影響增殖(Ki67、PCNA)和凋亡(Caspase-3、Bax和Bcl-2)相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，從而影響胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖和凋亡能力。

EMT對器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)等意義重大，在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干樣特性獲得和降解細(xì)胞外基質(zhì)中也起著重要作用，其有利于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，在癌癥的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[4]。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附因子，其表達(dá)下調(diào)或缺失是腫瘤EMT的關(guān)鍵步驟，伴隨著間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的表達(dá)上調(diào)，通過與β-catenin連接形成復(fù)合物維持上皮細(xì)胞穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用；Snail是EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)結(jié)合到E-cadherin的啟動子上時可抑制后者的基因轉(zhuǎn)錄，從而參與EMT進(jìn)程[30，31]。本研究表明，姜黃素劑量依賴性降低N-cadherin、Snail、Vimentin，增加E-cadherin蛋白表達(dá)，維持細(xì)胞間的黏附，降低細(xì)胞間的極性喪失，進(jìn)而抑制胃癌MGC-803細(xì)胞EMT進(jìn)程。

既往研究表明，姜黃素可以通過多種信號通路影響腫瘤細(xì)胞耐藥性、增殖和凋亡等，如調(diào)控CXC趨化因子/NF-κB信號途徑逆轉(zhuǎn)直腸癌細(xì)胞的奧沙利鉑耐藥[13]，Wnt3a/β-catenin/EMT 信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[4]。C-Myc是一種重要的癌基因，通過調(diào)節(jié)許多基因靶點，參與包括細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和凋亡的多個生物學(xué)過程，其高表達(dá)與多種不同種類癌癥預(yù)后不良相關(guān)[25]。當(dāng)β-catenin轉(zhuǎn)移到核內(nèi)時，可競爭性結(jié)合TCF4形成β-catenin/TCF4復(fù)合物，激活TCF4下游的轉(zhuǎn)錄因子，包括癌基因cycD和c-Myc，最終導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和腫瘤發(fā)生[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理細(xì)胞后，β-catenin、TCF4和下游的c-Myc蛋白表達(dá)均受到抑制，說明姜黃素有效下調(diào)β-catenin/TCF4信號通路，進(jìn)而抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、侵襲和EMT的發(fā)生。

此外，本文在胃癌異種移植瘤中發(fā)現(xiàn)，姜黃素增加了小鼠存活率和腫瘤細(xì)胞凋亡水平，降低了腫瘤體積和腫瘤組織中Ki67的表達(dá)量。實驗結(jié)果表明，姜黃素抑制了人胃癌MGC-803細(xì)胞的體內(nèi)外增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制β-catenin/TCF4信號通路密切相關(guān)，但在體內(nèi)實驗中缺少證明。但有研究已表明[33]，在膀胱癌原位移植瘤模型中，姜黃素制劑顯示出膀胱癌治療的前景。

綜上所述，本文初步探討了姜黃素對人胃癌MGC-803細(xì)胞體內(nèi)外增殖、凋亡、侵襲和間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素對人胃癌MGC-803細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用可能與抑制β-catenin/TCF4通路活化有關(guān)。本文的研究為姜黃素在胃癌治療中的應(yīng)用提供了實驗數(shù)據(jù)，下一步計劃研究β-catenin/TCF4信號通路在胃癌移植瘤模型中的作用及對腫瘤細(xì)胞干樣特性的影響。