王金蓮 陳 路 余孟英 何江濤

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科,南充 637000)

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨癌之一，在患者中表現(xiàn)為成骨細(xì)胞分化癌和惡性骨樣癌，常見(jiàn)于兒童和青少年[1]。骨肉瘤屬于遺傳不穩(wěn)定且高度惡性的骨間充質(zhì)腫瘤，其特征在于染色體結(jié)構(gòu)改變。目前，治療骨肉瘤通常采用化療和放射療法進(jìn)行治療和預(yù)防腫瘤擴(kuò)散，由于骨肉瘤患者對(duì)化療的抵抗力、預(yù)后不良、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等原因，患者5年生存率約為20%[2]。由于經(jīng)傳統(tǒng)外科手術(shù)、新輔助化療后患者生活質(zhì)量降低、腫瘤易復(fù)發(fā)等情況，骨肉瘤的治療進(jìn)展緩慢[3]，因此，探尋用于骨肉瘤的新型有效療法十分迫切。鳶尾黃素(Tectorigenin，TEC)是從射干[Belamcanda chinensis(L.)Redouté]中提取的一種有效成分,是一種天然的異黃酮。鳶尾黃素具有抗炎、抗增殖、抗氧化活性等多種藥理作用[4]，結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。鳶尾黃素已被發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌、肺癌、睪丸癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌和白血病具有治療作用。已有研究表明鳶尾黃素可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5]。本文旨在研究鳶尾黃素對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬作用的影響。

圖1 鳶尾黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Tectorigenin

1 材料與方法

1.1材料 鳶尾黃素(67359)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich,化學(xué)式：C16H12O6，分子量：300.26。Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI1640)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。MTT檢測(cè)試劑盒、Hoechst雙染試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所?？笲eclin-1、p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、cleaved caspase-3、Pl3K、AKT、mTOR購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。Bax、Bcl-2、GAPDH購(gòu)自Santa cruz。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨肉瘤MG63細(xì)胞來(lái)源于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2 d更換1次，每3 d進(jìn)行一次傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 在96孔板中加入細(xì)胞100 μl/孔，再加入不同劑量的鳶尾苷(0、10、50、100、200、400 μmol/L)，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入50 μl 1×MTT溶液，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)各劑量OD值。

1.2.3細(xì)胞分組 取實(shí)驗(yàn)待用細(xì)胞分為空白對(duì)照(Negative control，NC)組、阿霉素(Adriamycin，ADR)組、50 μmol/L TEC組、100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組檢測(cè)凋亡和自噬；NC組、50 μmol/L TEC組、100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路。

1.2.4Hoechst 離心收集人成骨肉瘤MG63細(xì)胞105個(gè)懸浮于1 ml培養(yǎng)基中，加入10 μl Hoec-hst33342染液，混勻，37℃孵育10 min，1 000 r/min離心5 min棄去上清液，加入1 ml Buffer A工作液懸浮細(xì)胞，加入5 μl PI染液，孵育10 min后混勻，在熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.5免疫熒光檢測(cè) 將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，吸掉封閉液，加入一抗，孵育過(guò)夜，PBS浸洗，避光加入熒光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。

1.2.6Western blot 首先將各組待測(cè)細(xì)胞用PBS清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，在100℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4℃條件條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過(guò)夜，清洗，然后在4℃條件下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1鳶尾黃素降低細(xì)胞活力 采用MTT試劑盒檢測(cè)不同劑量鳶尾黃素對(duì)MG63細(xì)胞活力的影響，如圖2所示，TEC 10 μmol/L細(xì)胞活力與TEC 0 μmol/L相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。TEC 50、100、200、400 μmol/L 細(xì)胞活力均顯著低于TEC 0 μmol/L(P<0.05)，且以劑量依賴(lài)的方式降低。說(shuō)明鳶尾苷具有抑制MG63骨肉瘤細(xì)胞活力的作用。

2.2鳶尾黃素促進(jìn)細(xì)胞凋亡 采用Hoechst染色檢測(cè)MG63細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖3A、B所示，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，即以亮藍(lán)色斑點(diǎn)密度代表細(xì)胞凋亡程度。ADR組細(xì)胞凋亡率極顯著高于NC組(P<0.01)，50、100、200 μmol/L TEC組細(xì)胞凋亡率均顯著高于NC組(P<0.05)，且以劑量依賴(lài)的方式凋亡率依次升高。蛋白免疫印跡試劑盒檢測(cè)BAX、Bcl-2、cleaved caspase-3表達(dá)，結(jié)果如圖3C、D所示，NC組BAX/Bcl-2表達(dá)極顯著低于A(yíng)DR組(P<0.01)，50 μmol/L TEC組BAX/Bcl-2表達(dá)較NC組無(wú)顯著差異(P>0.05)，100 μmol/L TEC組BAX/Bcl-2表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)，200 μmol/L TEC組BAX/Bcl-2表達(dá)極顯著高于NC組(P<0.01)；ADR組cleaved caspase-3表達(dá)極顯著高于NC組(P<0.01)，50 μmol/L TEC組cleaved caspase-3表達(dá)較NC組無(wú)顯著差異(P>0.05)，100、200 μmol/L TEC組cleaved caspase-3表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)。

圖2 鳶尾黃素降低細(xì)胞活力Fig.2 TEC reduces cell viabilityNote:*.P<0.05.

2.3鳶尾黃素促進(jìn)細(xì)胞自噬 采用免疫熒光檢測(cè)自噬體形成情況以及Western blot檢測(cè)Beclin-1、P62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平，免疫熒光觀(guān)察到ADR、50 μmol/L TEC、100 μmol/L TEC、200 μmol/L TEC組均有自噬顆粒聚集(圖4A)，ADR組、100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組自噬體數(shù)極顯著高于NC組(P<0.01，圖4B)。檢測(cè)Beclin-1、P62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達(dá)如圖4C、D所示。ADR組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)極顯著高于NC組(P<0.01)，100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)，NC組Beclin-1蛋白表達(dá)極顯著低于A(yíng)DR組(P<0.01)，顯著低于100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組(P<0.05)。ADR組P62蛋白表達(dá)極顯著低于NC組(P<0.01)，ADR組P62蛋白表達(dá)顯著高于100 μmol/L TEC組和200 μmol/L TEC組(P<0.05)。

2.4鳶尾黃素抑制PI3K/AKT/mTOR通路 Western blot檢測(cè)總PI3K、AKT、mTOR,磷酸化PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)，如圖5所示，NC組p-PI3K/PI3K水平顯著高于50、100、200 μmol/L TEC組(P<0.05)，50、100、200 μmol/L TEC組p-AKT/AKT水平顯著低于NC組(P<0.05)。100 μmol/L TEC、200 μmol/L TEC組p-mTOR/mTOR水平顯著低于NC組(P<0.05)。說(shuō)明鳶尾苷以劑量依賴(lài)的方式抑制PI3K/AKT/mTOR通路。

圖3 鳶尾黃素促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig.3 TEC promotes apoptosisNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 鳶尾黃素促進(jìn)細(xì)胞自噬(×400)Fig.4 TEC promotes autophagy(×400)Note:*.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 鳶尾黃素抑制PI3K/AKT/mTOR通路Fig.5 TEC inhibits PI3K/AKT/mTOR pathwayNote:*.P<0.05.

3 討論

骨肉瘤是一種罕見(jiàn)的間充質(zhì)腫瘤，其典型組織學(xué)特征為重度非典型性和多形性，瘤細(xì)胞大小不等，形態(tài)不一，可呈上皮樣、漿細(xì)胞樣、短梭形或梭形，腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生骨樣基質(zhì)，伴有不同程度的鈣化，可有或無(wú)高級(jí)別軟骨肉瘤成分，通常出現(xiàn)在生命的第一個(gè)或第二個(gè)十年，不幸的是，骨肉瘤患者的臨床結(jié)果在最近30多年內(nèi)沒(méi)有顯著改善[6]。治療進(jìn)展的停滯可能是由這種罕見(jiàn)腫瘤的遺傳、表觀(guān)遺傳和生物復(fù)雜性導(dǎo)致的，骨肉瘤治療的挑戰(zhàn)在于一個(gè)腫瘤到另一個(gè)腫瘤的極端變異，使得單一目標(biāo)方法不可能解決所有患者甚至大多數(shù)患者[7]。骨肉瘤的預(yù)后不良是由于其轉(zhuǎn)移和化療耐藥率高，已有研究顯示對(duì)骨肉瘤活性化療耐藥的藥物包括順鉑、阿霉素和高劑量甲氨蝶呤[8]。迄今為止，現(xiàn)代多藥物化學(xué)療法可使總體存活率得到最大改善，并且除了常規(guī)治療之外，未來(lái)采用組合靶向化療可能是改善存活率的有效手段。

據(jù)報(bào)道，惡性腫瘤的流行病學(xué)發(fā)病率被認(rèn)為與植物雌激素的豐度有關(guān)[9]，由于人們知識(shí)的普及使植物雌激素成為治療腫瘤的潛在藥物和支持藥物，例如絕經(jīng)后婦女采用雌激素替代療法，減少更年期癥狀和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及心血管疾病[10]。射干是一種傳統(tǒng)中藥，具有清熱、解毒、祛痰、消炎鎮(zhèn)痛的作用[11]，到目前為止，已經(jīng)從中鑒定了幾種植物雌激素，其中鳶尾黃素的抗癌作用已經(jīng)在不同類(lèi)型的癌癥和細(xì)胞系中顯示出來(lái)，Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃素對(duì)白血病HL-60細(xì)胞分化具有抑制作用。Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃素對(duì)人肝細(xì)胞癌HepG2具有促凋亡作用。因此，鳶尾黃素可能有助于治療骨肉瘤。

細(xì)胞凋亡是進(jìn)化上的保守過(guò)程，在生物體發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用。然而，在病理?xiàng)l件下，尤其是癌癥中，細(xì)胞喪失凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞有序死亡的能力，導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的增殖。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞過(guò)度表達(dá)許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在抵抗凋亡級(jí)聯(lián)的激活中起重要作用，其中之一是抗凋亡分子的過(guò)表達(dá)。B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)抗凋亡家族和促凋亡Bax蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Bax/Bcl-2的比例決定了細(xì)胞的命運(yùn)[14]。cleaved caspase-3是凋亡核心蛋白caspase-3活化時(shí)經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段，是有活性的caspase-3，其表達(dá)程度可反映caspase-3的活性狀態(tài)和細(xì)胞凋亡的大致情況。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2的比例來(lái)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，并通過(guò)減弱人骨肉瘤細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白信號(hào)來(lái)抑制增殖。Cheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸十二酯通過(guò)上調(diào)caspase依賴(lài)的凋亡途徑和抑制人骨肉瘤細(xì)胞中Bcl-2家族蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，鳶尾黃素可以通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2的比例和cleaved caspase-3的表達(dá)抑制人骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

自噬是一種必不可少且高度保守的細(xì)胞過(guò)程，其針對(duì)未使用的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞的細(xì)胞器進(jìn)行內(nèi)部消化[17]。自噬可以在凋亡缺陷細(xì)胞中起到替代細(xì)胞死亡機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制，可以抑制腫瘤[18]，矛盾的是，自噬也可被確定為細(xì)胞存活機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞存活的自噬可抑制細(xì)胞的抗癌活性[19]。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃素可以通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞自噬防止爆發(fā)性肝衰竭。本研究表明，自噬基因Beclin-1以劑量依賴(lài)的方式上調(diào)表達(dá)，上調(diào)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,下調(diào)P62水平，說(shuō)明鳶尾黃素以劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬。

PI3K/AKT/mTOR通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡抗性和腫瘤發(fā)生[21]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)也被認(rèn)為是一種典型的自噬信號(hào)傳導(dǎo)途徑，它將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核并激活多種細(xì)胞事件[22]，PI3K激活A(yù)kt的磷酸化，然后激活mTOR以最終觸發(fā)自噬的抑制。Sun等[23]研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素異黃酮的毛蕊花素通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡。Yin等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-155通過(guò)靶向PI3K和Rheb下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活性，以促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中的自噬。在本實(shí)驗(yàn)中，在鳶尾黃素處理后，MG63骨肉瘤細(xì)胞中PI3K、AKT和mTOR的表達(dá)水平下調(diào),暗示鳶尾黃素抑制PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬。

總的來(lái)說(shuō)，本文揭示了鳶尾黃素對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬作用的影響：鳶尾黃素降低MG63骨肉瘤細(xì)胞活力，以劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)MG63骨肉瘤細(xì)胞的凋亡和自噬，這作用可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果闡明了鳶尾黃素治療骨肉瘤的潛力。