李智奎 孔俊博 趙王林

(云南省中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，昆明 650021)

骨質疏松癥是由骨代謝障礙引發(fā)的一種全身性疾病，臨床表現(xiàn)為骨密度減少、骨脆性增加、骨微結構發(fā)生變化，容易發(fā)生骨折等，常見于老年人[1]。隨著我國社會逐步的老齡化、骨質疏松癥也日漸成為影響人們生活健康的主要因素，因此針對骨質疏松的治療就顯得尤為迫切和重要[2]。目前針對骨質疏松的致病原因特別是發(fā)病機制還不是很清楚，臨床上對骨質疏松的治療效果不是很理想，越來越多的證據(jù)表明骨髓間充質干細胞的功能異常是導致骨質疏松的原因之一[3]。骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種來源于中胚層具有多向分化功能的細胞，在特定的刺激條件下可以向骨或者脂肪轉化，是治療骨質疏松癥的理想方案[4]。MSCs在成骨或者成脂分化方向主要由不同的轉錄因子調控，目前研究認為其成脂分化由特異性基因PPARγ、Adipsin和FABP4調控，而成骨分化主要由RUNX2、ALP和OPN調控[5]。研究認為促進骨MSCs成脂分化的調控因子同時會抑制其成骨分化，反之亦然[6]。MSCs向成脂方向分化增加則成骨分化減少，此時骨髓內的脂肪含量會增加，從而導致成骨分化的減少，長期則會造成骨質疏松癥。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，對骨質疏松具有很好的治療效果。淫羊藿苷是一味傳統(tǒng)的溫腎陽、強筋骨的中藥，在臨床上經(jīng)常用來治療骨質疏松。有文獻報道淫羊藿苷可以有效促進MSCs向成骨方向分化而抑制其成脂分化[7]，但是其具體的調控機制尚不清楚。

因此本研究以大鼠的MSCs為研究對象，探討了不同濃度淫羊藿苷對其成骨成脂分化的作用以及具體的機制，為淫羊藿苷在臨床上治療骨質疏松提供可靠的實驗依據(jù)和藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1材料 1周齡SD大鼠乳鼠(中科院昆明動物研究所，中國)；淫羊藿苷(云南省食品藥品檢驗所，中國)；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液(HyClone，美國)；蛋白酶抑制劑(Roche，美國)；青鏈霉素混合液(Solarbio，北京)；β-actin、RUNX2、ALP、OPN、PPARγ、Adipsin和FABP4抗體(Abcam，英國)；ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Advansta，兔二抗購自英國 Abcam；CCK-8試劑盒(湖北天根生物，中國)；RNA逆轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)；Wnt/β-catenin信號通路小分子抑制劑PNU-74654(selleck，美國)；堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(Wako,日本)；骨鈣素檢測試劑盒(信然生物，中國)。

1.2方法

1.2.1大鼠MSCs的分離培養(yǎng)和純化 SD大鼠乳鼠脫臼處死，無菌手術操作臺取出大鼠雙側的股骨和脛骨。隨后消毒的手術剪在股骨和脛骨干骺端處剪斷，5 ml無菌注射器抽取骨髓間充質干細胞培養(yǎng)液，然后反復沖洗骨髓腔。將沖洗液混勻后，制備成細胞懸液接種至5 cm2培養(yǎng)瓶中，5%CO2和37℃細胞培養(yǎng)箱。48 h后換液，之后每2 d換一次液。當細胞密度長至70%左右，0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照1∶2比例接種至75 cm2培養(yǎng)瓶中，以此方法獲得第3代骨髓間充質干細胞備用。

1.2.2免疫熒光檢測CD44和CD90 各組對數(shù)生長期細胞，鋪板爬片，4%多聚甲醛固定，細胞破膜液浸泡破膜，PBS清洗，加入熒光標記的CD44和CD90一抗后4℃過夜，次日室溫30 min后吸取一抗PBS清洗，隨后顯色脫水，封片，熒光顯微鏡下觀察CD44和CD90表達情況。

1.2.3qRT-PCR TRIzol和氯仿用來提取獲得RNA，使用RNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成性質穩(wěn)定的cDNA。隨后qRT-PCR儀器檢測目的基因相對β-actin的表達水平。反應條件設定如下：在95℃預變性10 min；在95℃下退化10 s;在60℃下退火20 s并在72℃下延伸35 s。該2-ΔΔCt方法用于計算目的基因相對mRNA表達。引物序列如下。RUNX2：Forward 5′-GCACCCAGCCCATAATAGA-3′，Reverse 5′-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3′；ALP：For-ward 5′-CAAGGACCAACTACAACCA-3′，Reverse 5′-AG-GGAAGGGTCAGTCAGGTT-3′；OPN：Forward 5′-CCTGGACCTCATCAGCATTT-3′，Reverse 5′-GGAGACAGGAGGCAAGG-3′；PPARγ：Forward 5′-CCTTTACCACGGTTGATTTCTC-3′，Reverse 5′-GGCTCTACTTTGATGCACTTT-3′；Adipsin：Forward 5′-CACGTGTGCGGTGGCACCCTG-3′，Reverse 5′-CCCCTGCAAGTGTCCCTGCGGT-3′；FABP4：Forward 5′-GCGTAGAAGGGGACTTGGTC-3′，Reverse 5′-TTCCTGTCATCTGGGGT-GATT-3′；β-actin：Forward 5′-ACCCACTCCTCCACCT-TTG-3′，Reverse 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.4CCK-8增殖實驗 收集對數(shù)期細胞，調整細胞數(shù)4×105個/孔鋪板，隨后分別加入不同濃度的淫羊藿苷(10、20、30、40和50 ng/ml)，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對照組，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1～4 d。結束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設置酶標儀450 nm檢測細胞CCK-8混合液OD值進行活力分析。

1.2.5PNU-74654對淫羊藿苷作用于MSCs成骨和成脂分化的影響 Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制劑PNU-74654(10 μmol/L)作用于MSCs 30 min以阻斷Wnt/β-catenin信號通路，接著用淫羊藿苷(10 ng/ml)刺激MSCs，并與MSCs共孵育3 d，檢測成骨和成脂基因的表達。

1.2.6Western blot 調整MSCs細胞數(shù)5×104ml-1，80%細胞密度時收集細胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后進行轉膜操作，轉膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.7骨鈣素活性檢測 收集對數(shù)期MSCs，調整細胞數(shù)4×105個/孔鋪板，隨后分別加入不同濃度的淫羊藿苷(10 ng/ml和40 ng/ml)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1～3 d。分別于培養(yǎng)第1、2、3天三個時間點收集培養(yǎng)上清液，并密封置于-20℃冰箱保存。于第3天時將所有收集的上清液置于37℃溫箱解凍后,按信然生物有限公司OC測定試劑盒的說明書進行操作，設置酶標儀450 nm檢測細胞上清OD值進行活力分析。

2 結果

2.1骨髓間充質干細胞的鑒定 全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)初期細胞以懸浮為主，培養(yǎng)時間延長逐漸貼壁生長，并表現(xiàn)出各種形態(tài)，顯微鏡觀察多數(shù)呈梭形的成纖維細胞樣。而CD44和CD90作為MSCs的陽性標志，為了鑒定分離的細胞是否為MSCs，免疫熒光觀察CD44和CD90的表達，結果發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)細胞的陽性標志CD44和CD90均表現(xiàn)出紅色熒光遍布胞質(圖1)，說明分離的細胞為大鼠骨髓間充質干細胞。

2.2淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞增殖的影響 為了檢測淫羊藿苷對MSCs分化的影響，首先檢測了其對MSCs增殖作用的影響，10、20、30、40和50 ng/ml 不同濃度的淫羊藿苷分別作用于MSCs 1～4 d，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對照組，隨后每天CCK-8試劑盒檢測MSCs增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)10、20、30和40 ng/ml淫羊藿苷在1～4 d對MSCs增殖均無影響，但50 ng/ml淫羊藿苷在第3～4天時明顯抑制MSCs增殖(P<0.05)，見圖2。這說明低濃度的淫羊藿苷對MSCs增殖無影響，而高濃度的淫羊藿苷起到抑制MSCs增殖的作用，因此后續(xù)研究不同濃度的淫羊藿苷分別以10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷作為給藥濃度。

2.3淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞成脂分化的影響 MSCs向成脂方向分化則成脂的特異性基因PPARγ、Adipsin和FABP4表達會增加。為了檢測不同濃度淫羊藿苷對MSCs成脂分化的影響，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對照組，隨后qRT-PCR和Western blot檢測PPARγ、Adipsin和FABP4表達，結果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，10 ng/ml的淫羊藿苷抑制PPARγ、Adipsin和FABP4的表達(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷與空白對照組相比，則PPARγ、Adipsin和FABP4的表達明顯增加(P<0.05),見圖3。說明10 ng/ml 的淫羊藿苷可以抑制MSCs的成脂分化，而40 ng/ml淫羊藿苷可以促進MSCs的成脂分化。

圖1 免疫熒光檢測骨髓間充質干細胞陽性標志CD44和CD90的表達Fig.1 Immunofluorescence detection of bone marrow mesenchymal stem cell positive markers CD44 and CD90 expression

圖2 不同濃度淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of icariin on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cellNote:*.P<0.05,***.P<0.001.

2.4淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響 MSCs的成骨分化與成脂分化是雙向的，那么10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷成脂分化的不同作用，是否也體現(xiàn)在對MSCs的成骨分化作用上。同樣以10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對照組，隨后qRT-PCR和Western blot檢測成骨特異性基因RUNX2、ALP和OPN表達，結果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，10 ng/ml的淫羊藿苷顯著增加RUNX2、ALP和OPN的表達(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷與空白對照組相比，則RUNX2、ALP和OPN的表達顯著降低(P<0.05),見圖4。說明10 ng/ml的淫羊藿苷可以促進MSCs的成骨分化，而40 ng/ml淫羊藿苷可以抑制MSCs的成骨分化。與淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞成脂分化結果相符合。

2.5淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞骨鈣素活性的影響 為了進一步驗證10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對MSCs成骨分化的影響，骨鈣素檢測試劑盒用來檢測MSCs骨鈣素活性的變化，結果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，10 ng/ml淫羊藿苷可以顯著提高骨鈣素的活性(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷則降低骨鈣素的活性(P<0.05)，見圖5。說明10 ng/ml淫羊藿苷可以促進MSCs成骨誘導后細胞體外鈣化，提高細胞內骨鈣素活性，促進鈣結節(jié)形成。

圖3 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞成脂分化的影響Fig.3 Effects of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:A.qRT-PCR results;B.Western blot result.**.P<0.001,***.P<0.05

2.6淫羊藿苷激活骨髓間充質干細胞成骨分化中Wnt/β-catenin信號通路 為了探究淫羊藿苷誘導MSCs成骨成脂分化中Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮的作用。用10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷分別刺激骨髓間充質干細胞0、30和60 min后，提取蛋白，Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、Wnt7和GSK-3β。結果表明，與空白對照組相比，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷均可以顯著提高Wnt/β-catenin信號通路活化標志蛋白β-catenin和Wnt7的表達(P<0.05)，抑制β-catenin降解蛋白GSK-3β的表達(P<0.05)，見圖6。且這種蛋白調控表達均在淫羊藿苷給藥30 min時達到最高值。說明不同濃度的淫羊藿均是激活Wnt/β-catenin信號通路干預MSCs成骨分化或者成脂分化的。

圖4 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞成脂分化的影響Fig.4 Effects of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:A.qRT-PCR results;B.Western blot result.**.P<0.001.

圖5 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞骨鈣素活性的影響Fig.5 Effect of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on osteocalcin activity of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:*.P<0.05.

圖6 10 ng/ml和40 mg/ml淫羊藿苷對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、Wnt7和GSK-3β的影響Fig.6 Effects of 10 ng/ml and 40 mg/ml icariin on Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins β-catenin,Wnt7 and GSK-3βNote:**.P<0.01,***.P<0.001.

圖7 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞的促成骨基因表達和抑成脂基因表達的效應被PNU-74654 部分阻斷Fig.7 Effect of 10 ng/ml and 40 mg/ml icariin on bone-promoting gene expression and inhibition of adi-pogenic gene expression in bone marrow mesen-chymal stem cells was partially blocked by PNU-74654Note:***.P<0.001.

2.7淫羊藿苷調控Wnt/β-catenin信號通路干預骨髓間充質干細胞成骨成脂分化 為了進一步驗證不同濃度的淫羊藿苷是通過調控Wnt/β-catenin信號通路干預MSCs成骨分化或者成脂分化。用Wnt/β-catenin信號通路特異性小分子抑制劑PNU-74654(10 μmol/L)給藥處理MSCs。在淫羊藿苷刺激誘導MSCs之前，PNU-74654預先給藥處理0.5 h，緊接著10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，隨后使用qRT-PCR和Western blot檢測成骨基因RUNX2、ALP和OPN和成脂基因PPARγ、Adipsin和FABP4的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)不同濃度淫羊藿苷對MSCs的成骨和成脂分化干預效應均被PNU-74654部分阻斷，見圖7。說明淫羊藿苷是通過Wnt/β-catenin信號通路干預MSCs成骨分化或者成脂分化的。

3 討論

骨髓間充質干細胞具有多分化的潛力，可以在一定條件誘導下定向分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成纖維細胞及肝細胞等[8]，針對人體老齡化主要疾病——骨質疏松癥具有潛在的治療價值，MSCs經(jīng)過特異性條件刺激可以誘導其向成骨或者成脂方向分化。傳統(tǒng)中醫(yī)藥作為豐富的醫(yī)藥寶庫，對骨質疏松具有很好的治療效果，而淫羊藿苷作為代表性藥物常用于臨床治療骨質疏松。淫羊藿又名仙靈脾，是傳統(tǒng)的溫腎陽、強筋骨的中藥，已有研究表明淫羊藿總黃酮或黃酮各單體都具有抗骨質疏松的作用[9]，但是淫羊藿苷抗骨質疏松的作用如何，其發(fā)揮作用的分子機制都尚不清楚。因此本研究以SD大鼠分離純化的MSCs為研究對象，不同濃度淫羊藿苷刺激誘導MSCs，觀察其對MSCs成骨和成脂雙向分化的作用。

本研究首先研究了淫羊藿苷對MSCs增殖的影響，初步確定淫羊藿苷的作用濃度，結果發(fā)現(xiàn)10～40 ng/ml的淫羊藿苷對MSCs增殖均無影響，而50 ng/ml 的淫羊藿苷從第3天開始顯著抑制MSCs增殖作用。為了研究不同濃度淫羊藿苷對MSCs成骨和成脂雙向分化干預的研究，在細胞增殖結果的基礎上篩選10 ng/ml和40 ng/ml作為后續(xù)研究中的兩個不同給藥濃度。有文獻報道PPARγ、Adipsin和FABP4是成脂特異性基因，其在脂肪形成的過程中具有重要的作用，通常作為成脂的標志蛋白用來檢測脂肪的形成和增殖[10]，而RUNX2、ALP和OPN是成骨的重要標志蛋白[11]。本研究結果表明，不同濃度的淫羊藿苷，特別是10 ng/ml的淫羊藿苷抑制了MSCs成脂分化促進了成骨，顯著降低了PPARγ、Adipsin和FABP4的表達，相反促進了RUNX2，ALP和OPN基因的表達，同時通過油紅O染色10 ng/ml的淫羊藿苷顯著抑制了脂滴的形成，茜素紅染色則表明其促進了鈣結節(jié)的形成；而40 ng/ml的淫羊藿苷則表現(xiàn)出了相反的實驗結果，其促進了MSCs的成脂分化，抑制成骨分化。

有文獻指出Wnt/β-catenin信號通路在MSCs的增殖和分化過程中起到重要的作用[12,13]，本實驗結果表明不同濃度淫羊藿苷在刺激MSCs后激活了Wnt/β-catenin信號通路，提高了其活化標志蛋白β-catenin和Wnt7的表達，而抑制了降解蛋白GSK-3β的表達，說明不論是10 ng/ml還是40 ng/ml淫羊藿苷均可以激活Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin通路抑制實驗結果顯示，Wnt/β-catenin信號通路特異性小分子抑制劑PNU-74654阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，淫羊藿苷對MSCs的成骨和成脂分化干預均被顯著阻斷，但不能夠完全阻斷。本研究結果中，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷均可激活Wnt/β-catenin信號通路，但是卻誘導MSCs出現(xiàn)相反的分化方向，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的具體機制又如何，這將是我們下一步的研究重點。