楊 玉 王 艷 姜晶晶 段強軍 邵 菁 汪天明 汪長中

(安徽中醫(yī)藥大學，合肥 230012)

炎癥小體(Inflammasome)是一類由胞漿內(nèi)模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)參與組裝的多蛋白復合體，在感染性疾病、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等多種疾病中扮演著重要的角色。其中，NLRP3炎癥小體是迄今為止結構和功能研究得最為明確的炎癥小體，其在抗感染天然免疫中的作用近年來受到高度關注[1，2]。

外陰陰道念珠菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是女性生殖道中最常見的真菌感染性疾病。最新研究表明，VVC時，白念珠菌與巨噬細胞相互作用，通過TLR4/NF-κB通路激活NLRP3炎癥小體，產(chǎn)生過量的炎癥因子IL-1β和IL-18，造成陰道黏膜免疫炎癥性損傷。因此，NLRP3炎癥小體被認為是治療VVC的一個重要靶標[3]。研究顯示，許多中藥對NLRP3炎癥小體的活化具有調(diào)節(jié)作用[4]，本課題組近年來致力于中藥抗VVC研究，發(fā)現(xiàn)中藥復方白頭翁湯正丁醇提取物對VVC模型小鼠有顯著的治療作用[5]。鹽酸小檗堿是白頭翁湯正丁醇提取物中含量最多的有效成分[6]，但鹽酸小檗堿能否對VVC時的NLRP3炎癥小體發(fā)揮抑制作用？本實驗擬觀察鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激下巨噬細胞NLRP3炎癥小體及TLR4/NF-κB通路的影響，從炎癥小體角度闡明白頭翁湯正丁醇提取物抗VVC的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)購自中國科學研究院上海細胞庫；白念珠菌標準株SC5314由解放軍第二軍醫(yī)大學姜遠英教授提供；FITC-小鼠抗人CD68抗體，批號：11-0689-41購自invitrogen公司；鹽酸小檗堿，批號：MUST-18081510購自成都曼斯特生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，批號：ATSFE1401購自Abbkine公司；RPMI1640，批號：AE26543277購自Hyclone公司；胎牛血清,批號：JC53576購自Clarkbio公司；PMA，批號：P1585購自Sigma公司；IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒，批號：201812購自上海一研生物科技有限公司；β-actin抗體，批號：12w2944，TLR4抗體，批號：16c5074，Pro-caspase1抗體，批號：AF5418均購自Affinity公司；ASC抗體，批號：ATSAP1701購自Abbkine公司；MyD88抗體,批號：GR3183101-3購自Abcam公司；NF-κB抗體，批號：8242t，NLRP3抗體，批號：15101s，Cleaved Caspase1抗體，批號：4199t均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1巨噬細胞的誘導及鑒定[7]在含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基的6孔板中，按8×105ml-1密度接種THP-1細胞，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡下每天觀察細胞懸浮生長情況。除正常組外，其他加入100 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)作用24 h；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，收集細胞，用PBS清洗后，室溫固定15 min，用PBS清洗2次，破膜及加抗人CD68抗體，4℃避光孵育30 min。洗滌2次后加入500 μl PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測巨噬細胞的分子標志。

1.2.2白念珠菌最佳濃度的檢測 在誘導成功的巨噬細胞中，加入100 μl終濃度分別為0、2.5×106CFU/ml、2×106CFU/ml、1.5×106CFU/ml、1×106CFU/ml、8×105CFU/ml、5×105CFU/ml的白念珠菌。每孔加入10 μl的CCK-8，1 h后酶標儀測定450 nm下各孔的吸光度值；同時，選取比較有代表性的白念珠菌的濃度與誘導成功的巨噬細胞共培養(yǎng)4 h，在倒置顯微鏡下觀察白念珠菌對巨噬細胞形態(tài)的影響。

1.2.3鹽酸小檗堿安全濃度的檢測 在誘導成功的巨噬細胞中，加入100 μl終濃度分別為0、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml的鹽酸小檗堿，培養(yǎng)4 h后，每孔加入10 μl的CCK-8，1 h后酶標儀測定450 nm波長下各孔的吸光度值。

1.2.4鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激下巨噬細胞NLRP3炎癥小體影響的檢測

1.2.4.1ELISA檢測IL-1β、IL-18表達水平 將誘導成功的巨噬細胞分為3組：正常對照組、模型組、給藥組。正常對照組只含巨噬細胞；模型組包含巨噬細胞以及白念珠菌(1.5×106CFU/ml)；給藥組：在模型組基礎上加入終濃度為16 μg/ml的鹽酸小檗堿，培養(yǎng)4 h 。取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定IL-1β、IL-18。

1.2.4.2Western blot法檢測TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Cleaved Caspase1蛋白的表達 巨噬細胞及分組同1.2.4.1。用質(zhì)量分數(shù)為10%及12%的SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)到 PVDF膜上，封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。加入一抗β-actin(兔抗，1∶1 000)、TLR4(兔抗，1∶1 000)、MyD88(兔抗，1∶1 000)、NF-κB(兔抗，1∶1 000)、NLRP3(兔抗，1∶800)、ASC(兔抗，1∶1 000)、Pro-caspase1(兔抗，1∶1 200)、Cleaved Caspase1(兔抗，1∶800)，4℃冰箱孵育過夜后，TBST洗滌3次，每次10 min。加入相應的二抗(羊抗兔，1∶20 000)孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用ECL顯影曝光。

2 結果

2.1巨噬細胞的誘導情況 如圖1所示，圖1A為THP-1細胞，呈懸浮狀，圓而小，折光率好。圖1B為THP-1細胞經(jīng)PMA作用24 h后誘導分化成巨噬細胞，呈貼壁生長，體積較大，呈簇狀聚集，大多數(shù)細胞有偽足伸出。

CD68為人巨噬細胞重要標志分子。如圖2所示，通過流式細胞術可以觀察到THP1細胞經(jīng)100 ng/ml PMA處理24 h后，細胞CD68分子的表達量明顯增加。

圖1 倒置顯微鏡下觀察THP1細胞及經(jīng)PMA誘導的巨噬細胞(×200) Fig.1 THP1 cells and macrophages induced by PMA(×200)Note:A.THP1 cells;B.Macrophages induced by 100 ng/ml PMA for 24 h.

2.2白念珠菌最佳濃度的確定 如圖3、4所示，與正常對照組比較，隨著白念珠菌濃度的遞增，巨噬細胞的存活率逐漸降低，當白念珠菌濃度為1.5×106CFU/ml時，巨噬細胞的存活率50%左右。實驗選擇1.5×106CFU/ml作為白念珠菌造模濃度。

2.3鹽酸小檗堿安全濃度的確定 如圖5所示，與正常組比較，鹽酸小檗堿終濃度為32 μg/ml及64 μg/ml 時細胞活力顯著降低，而終濃度在4、8和16 μg/ml時對細胞活力影響相對較小。本實驗選取16 μg/ml的鹽酸小檗堿為供試藥。

2.4鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激下巨噬細胞NLRP3炎癥小體表達的影響

圖2 流式細胞術分析THP-1細胞及PMA誘導的巨噬細胞的CD68表達Fig.2 Flow cytometry analysis of CD68 expression in THP-1 cells and PMA-induced macrophagesNote:The red curve represents THP-1 cells;the blue curve represents PMA-induced macrophages.Compared with the THP-1 group,**.P<0.01.

圖3 不同濃度白念珠菌對巨噬細胞活力的影響Fig.3 Effect of different concentrations of C.albicans on macrophage Note:Compared with the normal group,**.P<0.01.

2.4.1鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激巨噬細胞后IL-1β、IL-18表達水平 如圖6所示，模型組IL-1β、IL-18的分泌明顯高于正常組，給予16 μg/ml鹽酸小檗堿后IL-1β、IL-18分泌顯著降低(P<0.01)。

2.4.2鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激下巨噬細胞TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase1、Cleaved Caspase1蛋白表達的影響 如圖7所示，與正常組相比，模型組TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase1、Cleaved Caspase1蛋白表達均顯著升高；與模型組相比，16 μg/ml鹽酸小檗堿干預后，TLR4、NF-κB、NLRP3、Cleaved Caspase1表達明顯下調(diào)(P<0.05)，但MyD88、ASC、Pro-caspase1無明顯變化。

圖4 倒置顯微鏡下觀察白念珠菌與巨噬細胞共培養(yǎng)(×200)Fig.4 Coculture of C.albicans and macrophages obser-ved by inverted microscope(×200)Note:A.Macrophages;B,C and D.Macrophages co-cultured with C.albicans at final concentrations of 5×106,1.5×106 and 2.5×106 CFU/ml,respectively.Morphology under the microspcope confirmed that 1.5×106 CFU/ml of C.albicans showed obvious hyphae.

圖5 鹽酸小檗堿安全濃度篩選Fig.5 Screening of safe concentration of berberine hydrochloride Note:Compared with the normal group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖6 鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激下巨噬細胞IL-1β、IL-18分泌水平的影響Fig.6 Effect of berberine hydrochloride on IL-1β、IL-18 secretion from macrophages by Candida albicans Note:Compared with the normal group,**.P<0.01;compared with the model group，##.P<0.01.

圖7 鹽酸小檗堿對白念珠菌刺激下巨噬細胞NLRP3及TLR/NF-κB通路蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of berberine hydrochloride on expression of NLRP3 inflammasome and TLR4/NF-κB signaling pathway when macrophages stimulated by Note:Compared with the normal group,*.P<0.05,**.P<0.01;compared with the model group #.P<0.05.

3 討論

白念珠菌是酵母-菌絲二相性真菌。外陰陰道念珠菌病(VVC)發(fā)生時，白念珠菌須由酵母相轉(zhuǎn)化為菌絲相，菌絲穿過陰道上皮細胞或者從細胞間隙進入黏膜下，與趨化至黏膜下的巨噬細胞相互作用[8]。巨噬細胞表面的TLR4等受體識別菌絲表面的β-葡聚糖等病原相關分子模式(PAMPs)，經(jīng)MyD88促進轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導IL-1β與IL-18前體的產(chǎn)生；同時促進NLRP3/ASC/Pro-caspase1蛋白復合體組裝，Pro-caspase1自剪切成活化形式，活化的caspase1將IL-1β與IL-18前體剪切活化釋放至胞外[9，10]。在NLRP3炎癥小體活化過程中，TLR4/NF-κB通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，激活物對NLRP3炎癥小體的影響往往都涉及對該通路的作用，因此，尋找或研發(fā)針對該通路及其調(diào)控的NLRP3炎癥小體的藥物對于治療NLRP3炎癥小體相關的疾病具有積極意義。研究證實，VVC的發(fā)生與NLRP3炎癥小體形成密切相關[3]，且還發(fā)現(xiàn)，VVC患者陰道分泌物的IL-1β顯著高于正常組，若給予NLRP3抑制劑格列苯脲，則IL-1β的分泌量會大大降低[11]。因此，藥物抑制NLRP3炎癥小體活化以控制炎癥因子IL-1β的分泌成為治療VVC的一個重要策略。

本實驗通過形態(tài)學觀察結合流式細胞術證實，THP1細胞在PMA作用下成功誘導分化為巨噬細胞，用含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基作用4 h，容易將白念珠菌從酵母相誘導成菌絲相，而巨噬細胞只被菌絲相而非酵母相的白念珠菌刺激才可以產(chǎn)生NLRP3炎癥小體[12]。

實驗中，CCK8法篩選出與巨噬細胞共培養(yǎng)4 h的白念珠菌的最宜濃度為1.5×106CFU/ml，鹽酸小檗堿的安全用藥濃度范圍為4～16 μg/ml，并以16 μg/ml 濃度的鹽酸小檗堿作為干預藥物。

實驗發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在白念珠菌刺激下，ELISA檢測出的炎癥因子IL-1β、IL-18以及Western blot 顯示的TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase1、Cleaved Caspase1蛋白表達水平較高，而16 μg/ml 濃度的鹽酸小檗堿干預后，除了MyD88、ASC、Pro-caspase1無明顯變化外，IL-1β、IL-18、TLR4、NF-κB、NLRP3、Cleaved Caspase1表達水平均顯著降低，提示鹽酸小檗堿可能對TLR4/NF-κB通路及其介導的NLRP3炎癥小體發(fā)揮了下調(diào)作用，這也可能是以鹽酸小檗堿為主要組分的白頭翁湯正丁醇提取物治療VVC小鼠的作用機制之一。

實際上，鹽酸小檗堿對白念珠菌也具有一定的直接抗菌作用。包括本課題組在內(nèi)的多個研究小組發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿單獨或與氟康唑等藥物聯(lián)用對白念珠菌均顯示較強的抗菌作用[13-15]。但這些研究都是側重于體外環(huán)境中進行的鹽酸小檗堿的直接抗菌作用。而在宿主發(fā)生真菌感染時，往往涉及病原體與宿主間的相互作用，此時，宿主整體的免疫應答也發(fā)揮了重要作用。相較于適應性免疫而言，固有免疫在抗真菌感染過程中的作用更加重要，而炎癥小體就是固有免疫的重要組成部分。但問題是，在VVC及其他相關疾病中，NLRP3炎癥小體往往存在活化時產(chǎn)生過多的炎癥因子IL-1β和IL-18，導致靶器官或靶組織的免疫炎癥性損傷。因此，合適的藥物調(diào)控NLRP3炎癥小體及相應的TLR4/NF-κB通路很有必要。本研究即初步闡明了鹽酸小檗堿通過該通路而發(fā)揮其下調(diào)NLRP3炎癥小體的機制。

最新研究發(fā)現(xiàn)，陰道、口腔等黏膜發(fā)生白念珠菌感染時，菌絲能分泌一種重要的肽毒素——candidalysin，此種毒素為菌絲特異性基因ECE1表達的產(chǎn)物，可以激發(fā)巨噬細胞NLRP3炎癥小體，產(chǎn)生過多IL-1β，在黏膜感染時發(fā)揮損傷作用[12，16]。本研究中，鹽酸小檗堿主要是針對體外白念珠菌刺激下巨噬細胞NLRP3炎癥小體產(chǎn)生的影響，是否對體內(nèi)黏膜白念珠菌感染狀態(tài)下由candidalysin活化的NLRP3炎癥小體也產(chǎn)生同樣的影響尚待進一步研究。