王明煬 湛佳興 周 琦 劉慶陽(yáng) 徐凱智

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科 河北唐山 063000；①應(yīng)急總醫(yī)院

骨折是重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)患者死亡的原因之一?；颊咴谑状稳胱CU時(shí)通常會(huì)出現(xiàn)非感染性全身炎癥反應(yīng)[1]。在創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)中存活的患者通常由于細(xì)菌重復(fù)感染而引起膿毒癥[2]。傳統(tǒng)上認(rèn)為骨折可導(dǎo)致膿毒癥，然而希臘人發(fā)現(xiàn)早期合并多發(fā)傷的膿毒癥患者的存活率高于無(wú)多發(fā)傷的患者，并且認(rèn)為IL-10的釋放可能是膿毒癥患者預(yù)后良好的原因之一[3]。研究表明，調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞(CD11c-CD45RBhigh DCs)可以從存在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF-α和IL-10的骨髓細(xì)胞中提取，活化后分泌高水平的IL-10。與正常DC產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子不同，CD11c-CD45RBhigh DCs產(chǎn)生較少的促炎細(xì)胞因子，且優(yōu)先產(chǎn)生IL-10[4]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者假設(shè)，骨折通過激活先天免疫，促進(jìn)骨髓增殖分化，增加CD11c-CD45RBhigh DCs的數(shù)量對(duì)膿毒癥小鼠起到保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇6～8周齡的小鼠并且體質(zhì)量約20g的雄性C57BL / 6小鼠(購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。在20℃～22℃，濕度(55±5)%的環(huán)境下分開飼養(yǎng)1周，維持正常的晝夜規(guī)律，不限制水和食物的攝入。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 培養(yǎng)皿、剪刀、離心機(jī)、細(xì)胞過濾器、流式細(xì)胞儀、超凈臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、膠原酶D溶液、生物素化的小鼠樹突細(xì)胞富集混合物、RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100IU/mL和鏈霉素100IU/mL)。

1.2實(shí)驗(yàn)②方法 ①創(chuàng)傷模型制作：用戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，小鼠仰臥位固定在操作臺(tái)上，在平行于腹部左腹內(nèi)斜肌和左腹橫肌的皮膚上形成4～5mm的小切口，分離開肌肉與血管暴露股骨干，用持針鉗碾碎股骨干，然后分層進(jìn)行縫合。假手術(shù)是指只進(jìn)行血管肌肉的分離，不進(jìn)行骨折操作。②膿毒癥模型制作：采用腹腔注射致死菌方式制作膿毒癥模型，對(duì)C57BL/6小鼠(6～8周)進(jìn)行腹腔注射107CFU多重菌(小鼠腸內(nèi)容物培養(yǎng)所得)。A組進(jìn)行致死菌腹腔注射；B組進(jìn)行假手術(shù)然后進(jìn)行致死菌腹腔注射；C組進(jìn)行創(chuàng)傷模型制作緊接著進(jìn)行致死菌腹腔注射。自由進(jìn)食飲水，保持正常的晝夜節(jié)律變化，觀察病死率變化。③獲取骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞的免疫細(xì)胞：使用25號(hào)針頭從小鼠的脛骨和股骨中吸出骨髓細(xì)胞。將肝臟和骨髓細(xì)胞的沉淀物重懸于PBS 1%牛血清白蛋白中，然后調(diào)節(jié)至1×106個(gè)細(xì)胞/ mL，并通過熒光激活細(xì)胞分選儀分析在明亮的綠色細(xì)胞上進(jìn)行分析。在2～3mL LRPMI 1640中獲得外周血并用紅細(xì)胞溶素處理。離心后，收集沉淀細(xì)胞。將分離的肝臟置于具有足夠膠原酶D溶液的6cm培養(yǎng)皿中以完全覆蓋培養(yǎng)皿的底部。然后使用1mL注射器和25G針頭向肝臟注射膠原酶D溶液，并使用一把鋒利的剪刀將組織切成小塊。將肝臟在膠原酶D溶液中于37℃溫育0.5小時(shí)，并在柱塞的幫助下將其輕輕地通過細(xì)胞過濾器。通過Ficoll Paque分離肝臟免疫細(xì)胞。④從骨髓、肝臟中純化CD11c-CD45RBhigh DCs：先前研究已經(jīng)詳細(xì)介紹了CD11c-CD45RBhigh DCs的制備方法[5]。簡(jiǎn)而言之，采用小鼠樹突狀細(xì)胞富集- DM 技術(shù)，從骨髓細(xì)胞和肝臟免疫細(xì)胞中陰性選擇這些DC。在純化的DCs中，使用生物素化抗小鼠CD11c單克隆抗體和IMag鏈霉親和素顆粒對(duì)CD11c-CD45RBhigh DCs進(jìn)行負(fù)選擇。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11c-細(xì)胞純度達(dá)95%以上。采用流式細(xì)胞儀(FACS Aria II)分離骨髓和肝臟CD11c-CD45RBhigh DCs。采用熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)測(cè)定CD11c-CD45RBhigh DCs的純度為>98%。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 創(chuàng)傷后膿毒癥實(shí)驗(yàn)：A組(n=10)：?jiǎn)渭冎滤谰腥荆籅組(n=10)：假手術(shù)加致死菌感染；C組(n=10)：骨折創(chuàng)傷加致死性菌感染。觀察A、B、C各組在致死菌攻擊下的病死率，分別在0、3、7、14天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取骨髓和肝臟細(xì)胞，并觀察其數(shù)量變化。

2 結(jié)果

2.1各組膿毒癥小鼠的病死率比較 通過對(duì)3組病死率的變化發(fā)現(xiàn)，B和C組與A組相比病死率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組與B組相比病死率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見骨折與假手術(shù)組都能降低膿毒癥小鼠的病死率，其中骨折組病死率降低得更加顯著，見圖1。

圖1 各組膿毒癥小鼠病死率比較

2.2骨髓細(xì)胞和肝臟細(xì)胞以及其中的CD11c-CD45RBhigh DCs的數(shù)量變化比較 骨髓細(xì)胞：第3天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第7天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他時(shí)間點(diǎn)各組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

骨髓細(xì)胞中CD11c-CD45RBhigh DCs：第3天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第7天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他時(shí)間點(diǎn)各組相比細(xì)胞數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

肝細(xì)胞第3和第7天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第7天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他時(shí)間點(diǎn)各組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

肝細(xì)胞中的CD11c-CD45RBhigh DCs第3和第7天C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第7天：C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14天：C組與A組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他時(shí)間點(diǎn)各組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1～4。

表1 骨髓中免疫細(xì)胞數(shù)量比較

表2 骨髓中CD11c-CD45RBhigh DCs數(shù)量變化比較

表3 肝臟中免疫細(xì)胞數(shù)量變化比較

表4 肝臟中CD11c-CD45RBhigh DCs數(shù)量變化比較

3 討論

創(chuàng)傷性損傷會(huì)破壞皮膚等大屏障，也會(huì)破壞細(xì)胞膜等微屏障，從而導(dǎo)致多種危險(xiǎn)分子的釋放,這種破壞引起了一個(gè)快速激活的先天免疫反應(yīng)的開始[6]。這些介質(zhì)稱為損傷相關(guān)的分子模式(DAMP)：線粒體DNA，組蛋白，高遷移率族蛋白1(HMGB1)和熱休克蛋白[7，8]，一些受體如toll樣受體(TLR)或晚期糖基化終產(chǎn)物的受體識(shí)別這些介質(zhì)[9-11]。當(dāng)人體單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在體外暴露于某些病原體相關(guān)分子模式(PAMP)或危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMP)，并在1周后用非相關(guān)病原體再刺激時(shí)，它們顯示出增強(qiáng)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。先天免疫細(xì)胞中這種非特異性記憶的誘導(dǎo)被稱為“訓(xùn)練性免疫”[13，14]。已經(jīng)充分證明樹突細(xì)胞(DCs)是專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，在先天免疫中起關(guān)鍵性作用，未成熟的DCs在炎癥組織中捕獲和處理抗原，并在炎癥微環(huán)境中發(fā)展為具有上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)和共刺激小分子的成熟DCs[15]，隨后進(jìn)入次級(jí)淋巴組織，將處理后的抗原呈現(xiàn)給幼稚T細(xì)胞，從而有效地產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：骨折后膿毒癥小鼠的病死率明顯降低，說明骨折通過激活先天免疫改善膿毒癥小鼠的預(yù)后。

作為第一道防線，先天免疫系統(tǒng)能夠檢測(cè)和應(yīng)對(duì)各種各樣的危險(xiǎn)，包括傳染性疾病、無(wú)菌性炎癥和惡性轉(zhuǎn)化[17]。在1993年，DeMaria和他的同事發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素抵抗的C3H/HeJ小鼠菌株也能抵抗出血性休克引起的死亡，這使得微生物免疫識(shí)別和損傷識(shí)別之間的相似性受到人們的廣泛關(guān)注[18]。研究已經(jīng)表明由創(chuàng)傷而產(chǎn)生的DAMPs和由病原微生物感染而產(chǎn)生的PAMPs都可以通過模式識(shí)別受體(PRRs)，如TLRs、NLRs、RAGE、嘌呤能受體或補(bǔ)體受體，將其信號(hào)傳遞給白細(xì)胞[19-21]。曾有研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射CD11c-CD45RBhighDCs可以顯著抑制熱損傷誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并降低病死率[22]；來(lái)自內(nèi)毒素耐受小鼠的CD11c-CD45RBhighDCs可減輕實(shí)驗(yàn)性急性肝衰竭[23]。2016年，美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)(JAMA)將膿毒癥(SEPSIS)定義為宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的一種危及生命的器官功能障礙[24]。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)骨折發(fā)生后CD11c-CD45RBhigh DCs的數(shù)量明顯增加，所以筆者認(rèn)為：當(dāng)機(jī)體再受到PAMPs(致死菌)攻擊時(shí)，由于有DAMPs預(yù)先刺激，此時(shí)機(jī)體既能迅速引起炎癥因子的釋放抑制細(xì)菌感染加重；機(jī)體預(yù)先產(chǎn)生的CD11c-CD45RBhigh DCs能夠抑制過度炎癥反應(yīng)從而維持機(jī)體免疫狀態(tài)平衡，所以CD11c-CD45RBhigh DCs的存在是骨折明顯地降低了膿毒癥小鼠的病死率的主要原因。

在實(shí)驗(yàn)中筆者對(duì)骨折組的骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞以及其中的CD11c-CD45RBhigh DCs進(jìn)行計(jì)數(shù)：骨折后骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞數(shù)以及其中的CD11c-CD45RBhigh DCs在前3天內(nèi)數(shù)量低于正常小鼠，之后逐漸升高并在骨折后第7天達(dá)到高峰。骨折后第7天細(xì)胞數(shù)逐漸減少至第14天降至對(duì)照水平。在第7天和第14天之間細(xì)胞數(shù)量均高于正常水平。因此筆者認(rèn)為骨折引起先天免疫的保護(hù)作用與適應(yīng)性免疫不同，有一定的時(shí)限：骨折后3天內(nèi)不僅對(duì)機(jī)體無(wú)保護(hù)作用，而且會(huì)明顯增加膿毒癥小鼠的病死率；骨折后第7天保護(hù)作用最強(qiáng)，此后逐漸減弱至第14天時(shí)基本降到正常水平。這也解釋了部分骨折患者會(huì)導(dǎo)致膿毒癥的原因，大致是因?yàn)樵诠钦酆笄?天未能對(duì)其進(jìn)行充分的抗感染治療，使其在免疫力較低的情況下受到了病原微生物的沖擊；類似的在骨折后第7天過度應(yīng)用激素類抗炎藥抑制了正常的免疫反應(yīng)，也大大降低了機(jī)體的免疫屏障。因此在臨床治療當(dāng)中，避免臨床治療與護(hù)理措施限制了免疫反應(yīng)的作用，需要充分考慮患者不同的免疫狀態(tài)對(duì)患者進(jìn)行及時(shí)和個(gè)性化管理。

雖然在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)了骨折對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用，但在部分個(gè)體中筆者發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)失血和骨折創(chuàng)傷程度嚴(yán)重的情況下，反而達(dá)不到預(yù)期的保護(hù)作用。因此，筆者推測(cè)當(dāng)創(chuàng)傷程度較小時(shí)，對(duì)機(jī)體的第二次打擊起到保護(hù)作用會(huì)與創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度成正比；相反的若創(chuàng)傷非常嚴(yán)重時(shí)，小鼠會(huì)死于免疫功能低下期間。在未來(lái)研究中大家可以通過創(chuàng)傷的數(shù)據(jù)化對(duì)機(jī)體的免疫狀態(tài)以及患者預(yù)后進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)。