（新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830000）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病（lumpy skin disease，LSD）是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的一種病毒性傳染病，又稱為牛疙瘩皮膚病、牛結(jié)節(jié)性皮炎和牛結(jié)節(jié)疹。LSD屬于急性和亞急性傳染病，臨床上主要癥狀為體溫升高、消瘦、淋巴結(jié)腫大、皮膚（黏膜、器官）表面廣泛性結(jié)節(jié)及皮膚水腫等。此外，該病毒還可致原發(fā)性和繼發(fā)性肺炎，母牛流產(chǎn)以及公牛暫時或永久不育，對養(yǎng)牛業(yè)危害較大，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須通報的動物疫病[1-2]。

LSD 于1929 年首次在贊比亞被報道，15 年后在博茨瓦納和南非地區(qū)出現(xiàn)。20 世紀(jì)70 年代，LSD 向北傳播到科尼亞和蘇丹，向西傳播到尼日利亞，隨后相繼傳播到毛里塔尼亞、馬里、加納和利比里亞等國家。2005 年后，巴林、科威特、阿曼、也門、以色列、黎巴嫩、伊朗、土耳其和約旦河西岸也相繼出現(xiàn)疫情。2015 年以來，LSDV 在歐洲東南部迅速蔓延，包括保加利亞、希臘、科索沃、前南斯拉夫馬其頓共和國、塞爾維亞和阿爾巴尼亞以及俄羅斯。2019 年8 月，我國首次在新疆地區(qū)確診此病。為加強(qiáng)對其監(jiān)測與防控，本文對該病及其檢測方法行了綜述。

1 病原學(xué)特征

LSDV 屬于痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV），其原型Neethling 毒株最初分離自南非[3]。LSDV 病毒粒子大小約為260～320 nm，有或者無包膜，形態(tài)相似，呈磚塊狀或橢圓形（副痘病毒除外）[4]。該病毒主要通過昆蟲（如蚊、蠅和虱）媒介機(jī)械傳播，其次通過自然接觸傳播，另外動物唾液污染的飼料和水也可能傳播。所有的痘病毒在細(xì)胞培養(yǎng)基上生長緩慢，可能需要進(jìn)行多次傳代，其可在牛和羊等多種動物細(xì)胞上繁殖，從而引起易于識別的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effects，CPE）[5]。此外，該病毒還可以在雞胚絨毛膜尿囊膜內(nèi)繁殖，引起肉眼可見的痘樣病變[6]。同時，在被LSDV 感染的家兔中可發(fā)現(xiàn)大面積的皮膚損傷。通過對LSDV 感染的單層細(xì)胞進(jìn)行蘇木精-伊紅染色并借助顯微鏡，可觀察到LSDV 復(fù)制發(fā)生在宿主細(xì)胞內(nèi)涵體的胞漿內(nèi)。

LSDV 屬于雙鏈DNA 病毒，基因組大小約為151 kbp，由一個具有相同2.4 kbp 反向末端重復(fù)序列的中央編碼區(qū)域和156 個假定基因組成，編碼宿主范圍、毒力和免疫逃逸的基因位于基因的末端[7]。利用現(xiàn)場樣本和疫苗毒株的限制性核酸內(nèi)切酶對其DNA 進(jìn)行分析，表明其與羊痘病毒毒株之間的同源性可達(dá)80%，且與山羊痘病毒（GTPV）和綿羊痘病毒（SPPV）的基因組核苷酸具有96%的同源性，因此簡單的血清學(xué)方法很難將其區(qū)分[8]。

LSDV 對熱敏感，55 ℃條件下2 h 或者65 ℃條件下30 min 便可滅活；耐凍融，在-90 ℃可保存10 年，在受感染的組織液4 ℃可保存6 個月。病毒粒子對酸或堿敏感，可在pH 6.6～8.6 的環(huán)境中長期存活；對20%的乙醚、氯仿、1%福爾馬林和一些洗滌（如十二烷基磺酸鈉劑）敏感。對次氯酸鈉（2%～3%）、苯酚（2%，15 min）、碘化合物（1:33稀釋液）和季銨化合物（0.5%）等也敏感。此外，該病毒粒子對陽光敏感，在黑暗條件下可保持活力長達(dá)幾個月[9]。

2 宿主范圍

牛和水牛都是LSDV 的自然宿主，其感染率分別為30.8%和1.6%[10-11]。山羊和綿羊被人工接種感染后通常在接種部位局部出現(xiàn)反應(yīng)，而其他的小型反芻動物未被報道感染LSDV。皮薄高產(chǎn)的奶牛品種對LSDV 高度易感，對于荷斯坦奶牛，高溫環(huán)境和為了牛奶高產(chǎn)的農(nóng)業(yè)實踐操作可能是導(dǎo)致其LSD 嚴(yán)重的原因[12]。然而印度牛和印度牛雜交等品種會對LSDV 有一些自然的抵抗力[13]。截至目前，遺傳因素對此病的影響程度還未知。

一般而言，LSDV 具有高度的宿主特異性，主要感染牛和水牛。較少的數(shù)據(jù)表明野生反芻動物也易于感染LSD，如黑斑羚和長頸鹿接種LSDV 后表現(xiàn)出臨床癥狀。最近，在南非的跳羚皮膚樣本中檢測到LSDV 核酸[14]。

3 臨床癥狀

LSD 具有急性、亞急性和慢性臨床癥狀，且有40%～50%的受感染動物會出現(xiàn)全身皮膚損傷；許多病例的臨床癥狀并不明顯但卻可能攜帶病毒，甚至可以傳播病毒。在自然條件下，LSD 的潛伏期是2～4 周，然而在實驗條件下所誘導(dǎo)的疾病，潛伏期通常只有4～14 d[2]。這種疾病在哺乳期的奶牛和小牛中，往往更嚴(yán)重[13]。發(fā)生臨床癥狀的動物，其發(fā)熱溫度甚至?xí)^41 ℃，在持續(xù)發(fā)熱的4～14 d，一般會伴隨有沮喪、不愿動、食欲不振、流口水、流眼淚和流鼻涕。此外，長期流眼淚可能會引起結(jié)膜炎，嚴(yán)重時會引起角膜渾濁和失明。淺表淋巴結(jié)，尤其是前腳淋巴結(jié)，角前和腮腺通常明顯增大[15]。

LSD癥狀通常發(fā)生在發(fā)熱反應(yīng)開始后48 h內(nèi)，其結(jié)節(jié)數(shù)量可能會很多，覆蓋全身，也可能只有零星幾個，頭部、頸部、會陰、生殖器、乳房和四肢等部位的皮膚易發(fā)。結(jié)節(jié)直徑范圍為5～50 mm，有邊界、堅固、圓形和凸起，涉及皮膚、皮下組織，有時甚至?xí)婕暗狡は录∪狻Ｓ行┬〗Y(jié)節(jié)可能會自發(fā)消退且不留任何痕跡，而有些小結(jié)節(jié)會引發(fā)潰瘍，可發(fā)生在結(jié)膜、口角、鼻孔、口腔黏膜、喉部、氣管、食道和皺胃。大結(jié)節(jié)通常會纖維化且持續(xù)數(shù)月。一些急性感染可能會發(fā)展成嚴(yán)重的部分皮下水腫，如垂皮，胸部、四肢、乳房、陰囊和外陰水腫。水腫四肢的皮膚可能會壞死脫落，出現(xiàn)嚴(yán)重潰瘍，進(jìn)而引起繼發(fā)性細(xì)菌感染；乳房部位的水腫和壞死病變可能會導(dǎo)致乳腺炎；在一些動物體內(nèi)，氣管和肺的壞死病變可能導(dǎo)致肺炎；氣管損傷愈合后結(jié)締組織的收縮可能會導(dǎo)致局部氣管塌陷，進(jìn)而導(dǎo)致窒息；公牛通常會暫時不育，也會導(dǎo)致永久不育；懷孕的母?？赡軙鳟a(chǎn)并會持續(xù)幾個月的不發(fā)情期[15-17]。

4 免疫應(yīng)答

對CaPV 感染的免疫主要是由細(xì)胞來介導(dǎo)，需要有效地刺激復(fù)制因子[18]。除了被釋放到血液中的包膜病毒外，大多數(shù)子代病毒仍然留在受感染的細(xì)胞內(nèi)。通過在細(xì)胞間傳播，這些病毒是循環(huán)抗體無法觸及和抵抗的。循環(huán)的抗痘病毒抗體能夠限制病毒在實驗動物中的傳播，但不能阻止病毒在感染部位的復(fù)制。先前感染或接種過疫苗的動物的免疫狀況與血清中抗體水平無關(guān)。所有CaPV 屬的病毒都由一個共同的主要抗原來中和抗體，因此從一種病毒感染中康復(fù)的動物被認(rèn)為至少部分可免受另一種病毒的感染。不論癥狀是否明顯，從LSD 自然感染中康復(fù)的動物均會產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的這些抗體能夠中和病毒并且對再次感染具有抵抗力[15]。血清中和試驗（SNT）、熒光抗體試驗（FAT）、間接熒光抗體試驗（IFAT）或瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗（AGID）無法區(qū)分CaPVs。血清學(xué)交叉感染和交叉保護(hù)試驗表明痘屬病毒具有交叉免疫反應(yīng)。

5 檢測手段

5.1 臨床診斷

LSD 可根據(jù)特異的臨床特征進(jìn)行診斷，然而當(dāng)癥狀不明顯時無法進(jìn)行確診。由牛皰疹病毒-2（BHV-2）感染、昆蟲叮咬、蠕形螨感染、盤尾絲蟲病、貝諾孢子蟲病和嗜皮菌病引起的皮膚損傷會與LSD 所引起的混淆[19]。一般情況下，BHV-2 感染引起的淺表皮膚病變較多，病程較短，且比LSD 病癥輕。此外，病理組織學(xué)表明BHV-2感染中存在的核內(nèi)包涵體與LSD 引起的胞質(zhì)內(nèi)的包涵體是相反的。因此，在LSD 病變發(fā)生后的一周左右，可通過電子顯微鏡檢測陰性活檢標(biāo)本或分離病毒進(jìn)行診斷。

5.2 實驗室技術(shù)

現(xiàn)場作出初步快速診斷確認(rèn)，是成功控制和根除流行地區(qū)和非流行地區(qū)LSD 的基礎(chǔ)。目前，首選的診斷工具為分子檢測方法，且正逐步取代傳統(tǒng)的檢測方法。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測盡管適用于群體水平，但是對個體水平檢測速度慢，結(jié)果不可靠，不能作為主要的檢測方法。

5.2.1 抗原檢測（活的病毒或病毒核酸）

5.2.1.1 PCR 方法 通用的實時定量PCR 方法在檢測CaPV 病毒時較其他診斷方法更為敏感。該檢測方法主要是檢測CaPV 病毒的DNA，因此不能區(qū)分同一屬的不同品種。RT-PCR 方法已經(jīng)在很多文獻(xiàn)中被報道[20]。采用RT-PCR 方法對CaPV 進(jìn)行檢測，比傳統(tǒng)的凝膠PCR 檢測方法更為靈敏。該方法的檢測水平每次反應(yīng)均少于10 個基因拷貝，與其他痘病毒無交叉反應(yīng)，在檢測其他痘病毒或者陰性樣本時，也未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。RTPCR 檢測方法具有定量、簡單、靈敏、特異等特點，可對CaPV 病毒進(jìn)行快速和高通量的測定。該方法在歐盟相關(guān)實驗室被廣泛使用，如果與自動提取相結(jié)合，可用于大規(guī)模樣本的檢測。種特異性RTPCR 方法可區(qū)分SPPV、GTPV 和LSDV[14]，該方法通過檢測3 種病毒不同的熔點溫度差異，對獲得的熒光熔融曲線進(jìn)行分析。聶福平等[21]建立的鑒別檢測牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒野生毒株的RT-PCR 方法，可有效用于臨床樣品的鑒別檢測。與RT-PCR相比，普通PCR 方法速度慢、靈敏度低、操作簡單、成本低；但對于某些資源有限以及專業(yè)人員缺乏的實驗室來說，普通PCR 是較好的選擇，只是該方法不能進(jìn)行定量。近幾年逐漸發(fā)展起來的便攜式現(xiàn)場測試PCR 方法已初步取得較為滿意的結(jié)果，在現(xiàn)場條件下使用方便，并可在1 h 內(nèi)獲得結(jié)果。由于試劑屬于凍干狀態(tài)，所以在現(xiàn)場檢測時不需低溫操作；樣品采集簡單方便，無需單獨進(jìn)行DNA 提取，EDTA 中的血液、皮膚損傷部位或所結(jié)的痂，唾液、眼睛和鼻子的分泌物均可作為樣品材料。

5.2.1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試驗（LAMP）LAMP已經(jīng)被很多文獻(xiàn)報道但是并未廣泛使用[22-23]，LAMP 方法的檢測結(jié)果是通過顏色的改變判定，因此其結(jié)果的解釋也可能會出現(xiàn)偏差。

5.2.1.3 電子顯微鏡 通常在1 d 之內(nèi)便可得到結(jié)果，但是電子顯微鏡技術(shù)需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)訓(xùn)練的實驗室人員。使用電子顯微鏡很難區(qū)分CaPV 和正痘病毒（Orthopoxvirus），因為二者在形態(tài)上比較接近。但是除了牛痘病毒，還沒有其他痘病毒可引起綿羊和山羊皮膚損傷。相反，CaPV 與副痘病毒屬不同，副痘病毒屬可引起牛的流行性口炎，這同樣可作為LSD 的鑒別診斷之一[15]。

5.2.1.4 病毒分離 主要用于確認(rèn)病毒的傳染性，并不適合基本診斷，如果有可用的組織培養(yǎng)系統(tǒng)，則可以在多種細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離。然而，CaPV在細(xì)胞培養(yǎng)上生長緩慢，通常需要進(jìn)行多次傳代。當(dāng)從皮膚樣本或者結(jié)痂中分離病毒時，經(jīng)常會被細(xì)菌和真菌污染。

5.2.2 抗體檢測

5.2.2.1 血清/病毒中和試驗 這是血清學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法在檢測有輕微臨床癥狀和接種后體內(nèi)低抗體度的動物還不夠敏感，且耗時耗力，因此不適合初步檢測或大量樣本的檢測。中和試驗的靈敏度在70%～96%之間，特異性可達(dá)100%[24]。但是，作為一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測方法，其標(biāo)準(zhǔn)化相對困難并且其敏感性在不同實驗室可能有變化。該檢測方法還需要使用活的病毒且必須在具有三級防護(hù)水平的實驗室進(jìn)行操作，同時還需有適合細(xì)胞培養(yǎng)的材料，如適當(dāng)?shù)脑?xì)胞或細(xì)胞系和參考血清，且樣本材料必須是受感染動物的血清。

5.2.2.2 間接熒光抗體試驗（IFAT）IFAT 也被用于抗體檢測。2008 年，埃塞俄比亞研究人員評估了IFAT 作為診斷工具檢測LSD 抗體，測定的容量為每板45 個樣品，這比中和試驗所檢測的樣本量大，但是該檢測方法可能與其他痘病毒具有交叉反應(yīng)[24]。由于背景熒光和細(xì)胞質(zhì)的非特異性染色，對IFAT 結(jié)果的解釋可能更為主觀，因此在解釋結(jié)果前需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

5.2.2.3 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗 檢測抗體時所需設(shè)施簡單，操作方便，但敏感度較低并且會與副痘病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)[25]。實時PCR 方法結(jié)合瓊脂凝膠電泳可對羊痘病毒進(jìn)行檢測、定量和區(qū)分[14]。Zheng 等[26]建立了雙重PCR 方法用于同時檢測和區(qū)分羊痘病毒和口瘡病毒，并對其DNA 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，所建立的方法檢出限為1 pfu，且具有較高的靈敏度和特異性。

5.2.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）ELISA具有敏感性和特異性高的優(yōu)點，但需注意試劑與儀器的選擇，兩者會影響其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。Authie[20]利用ELISA 檢測綿羊痘和山羊痘，敏感性為70%～100%，特異性為84%～100%。史宗勇等[27]采用ELISA 方法對山西北部圈養(yǎng)羊群羊痘進(jìn)行實驗室診斷技術(shù)研究，檢測的12 個樣品的OD值孔間變異系數(shù)小于10%，說明檢測結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。Babiuk 等[28]采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測山羊、綿羊和牛共231 份血清中羊痘病毒的特異性抗體，結(jié)果其敏感性為96%，特異性為95%。同樣，Bowden 等[29]采用重組羊痘病毒屬抗原建立間接酶聯(lián)免疫吸附法對病毒進(jìn)行檢測，經(jīng)過對42 種抗原的篩選，鑒定到有效表達(dá)的兩個羊痘病毒核心蛋白；當(dāng)對人工感染病毒的羊血清進(jìn)行檢測，ELISA 的敏感性和特異性范圍為95%～97%，且無交叉反應(yīng)。

6 防控建議

2019 年LSD 已傳至我國，對我國養(yǎng)牛業(yè)造成了一定打擊。為防控LSD 蔓延，政府及有關(guān)主管部門應(yīng)盡早建立LSD 的標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)，對防疫人員及養(yǎng)殖者開展培訓(xùn)和宣傳，建立疫苗儲備等。同時，各地方動物疫病預(yù)防控制部門應(yīng)加強(qiáng)LSD 診斷能力和監(jiān)測排查，在高危和低危地區(qū)對易感牛群進(jìn)行抽樣，確保第一時間發(fā)現(xiàn)疫情。