南文龍，李 林，鞏明霞，陸 游，2，吳曉東，陳義平

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是我國(guó)一類動(dòng)物疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）法定報(bào)告動(dòng)物疫病。我國(guó)自2018 年8月確診首起疫情以來(lái)，該病已擴(kuò)散蔓延至除臺(tái)灣、澳門(mén)外全國(guó)所有的其他?。ㄖ陛犑小⒆灾螀^(qū)），給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)及相關(guān)行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到肉品市場(chǎng)供應(yīng)。

目前，本病尚無(wú)有效疫苗可以預(yù)防，疫病防控主要依靠實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施。實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速的病原學(xué)檢測(cè)是ASF 防控的基礎(chǔ)，可為各項(xiàng)防控措施的制定、實(shí)施及評(píng)估提供有效支持。本文就相關(guān)病源學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期為我國(guó)ASF 防控和診斷技術(shù)研發(fā)提供參考。

1 病毒分離

采集豬血液、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，接種豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）等原代細(xì)胞。ASFV 會(huì)在易感細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。在細(xì)胞培養(yǎng)中加入豬紅細(xì)胞后，多數(shù)ASFV 毒株會(huì)產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附反應(yīng)（hemadsorption，HAD），即在感染的白細(xì)胞周?chē)截i紅細(xì)胞形成“玫瑰花環(huán)”。由于部分ASFV 毒株并不產(chǎn)生HAD，若分離培養(yǎng)物中出現(xiàn)CPE 而沒(méi)有出現(xiàn)HAD，則需采用免疫熒光或PCR 等方法確認(rèn)細(xì)胞中是否存在ASFV；如果未出現(xiàn)CPE，免疫熒光和PCR 檢測(cè)也為陰性，需傳代3～5 次，方可確認(rèn)為陰性。在首次暴發(fā)ASF的地區(qū)，經(jīng)PCR、免疫熒光等方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，建議采用HAD 方法進(jìn)行病毒鑒定[1-2]。

2 抗原檢測(cè)

2.1 免疫熒光法

免疫熒光法是OIE推薦的ASF檢測(cè)方法之一。通過(guò)異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記抗ASFV 特異性抗體，實(shí)現(xiàn)臟器涂片或薄層冷凍切片、細(xì)胞培養(yǎng)物中的ASFV 抗原的檢測(cè)。免疫熒光法是鑒別不產(chǎn)生HAD 的ASFV 毒株感染，以及區(qū)分ASFV 與其它病毒（如偽狂犬病毒）產(chǎn)生CPE 的重要手段。免疫熒光法檢測(cè)對(duì)于急性ASF 感染高度敏感，但在亞急性和慢性感染中，敏感性顯著下降，可能與感染組織中已形成抗原抗體復(fù)合物，阻斷了ASFV 抗原與檢測(cè)用抗體的結(jié)合有關(guān)[1-2]。

2.2 ELISA 法

Wardley 等[3]采用抗ASFV 的特異性血清IgG作為包被蛋白，建立了間接ELISA 方法，檢測(cè)ASFV 抗原濃度為50～500 HAD50/mL。Vidal 等[4]采用抗ASFV VP72 蛋白的單克隆抗體，建立了夾心ELISA 方法，檢測(cè)VP72 抗原濃度為0.05 μg/mL，全病毒為2.3×102PFU/mL。Hutchings 等[5]研究發(fā)現(xiàn)采用抗ASFV 的多克隆抗體，比采用抗VP72 蛋白單克隆抗體包被蛋白時(shí)，檢測(cè)ASFV 抗原稍敏感。

目前，已有商品化ASFV 抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒出售，與熒光定量PCR 方法相比，具有設(shè)備要求低、成本低、操作方便等優(yōu)勢(shì)，但敏感性和特異性有待提高?；诖?，已有學(xué)者和公司將化學(xué)發(fā)光技術(shù)應(yīng)用于ELISA 檢測(cè)結(jié)果判定，建立了ASFV 化學(xué)發(fā)光ELISA，其檢測(cè)敏感性顯著提升。與免疫熒光法相似，在亞急性和慢性感染中，抗原ELISA 的檢測(cè)敏感性顯著降低。糧農(nóng)組織（FAO）建議ELISA 方法用于“群體”樣本大規(guī)模篩查，并需輔助以其他檢測(cè)方法[1]。

2.3 免疫層析試紙條法

Sastre 等[7]應(yīng)用抗VP72 蛋白單克隆抗體研制免疫層析試紙條。對(duì)實(shí)驗(yàn)感染豬的ASFV 血液樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該試紙條可檢測(cè)病毒含量超過(guò)104HAU 的樣本；臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，PCR方法陽(yáng)性檢出率最高，試紙條陽(yáng)性檢測(cè)率（60%）高于商品化的抗原檢測(cè)ELISA 試劑盒（48%）。吳海濤等[8]以抗VP72 蛋白單克隆抗體作為金標(biāo)抗體，以ASFV 多克隆抗體作為檢測(cè)線，制備了膠體金試紙條，針對(duì)重組VP72 蛋白的最低檢出限在20 ng/mL 左右。劉波[9]以抗K205 蛋白單克隆抗體作為金標(biāo)抗體，用兔抗K205R 蛋白抗體作為檢測(cè)線，制備的膠體金試紙條針對(duì)重組K205R 蛋白的最低檢出限為30～40 ng/mL。

經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，目前膠體金免疫層析試紙條仍是最成熟，也是普遍應(yīng)用于ASF 檢測(cè)的方法，其臨場(chǎng)使用簡(jiǎn)便、快速，但也存在敏感性低的不足。近年，一些免疫學(xué)新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，市面已出現(xiàn)基于乳膠凝集、熒光微球技術(shù)研發(fā)的非洲豬瘟病原檢測(cè)用免疫層析試紙條，新方法的運(yùn)用顯著提升了檢測(cè)敏感性，具有良好應(yīng)用前景。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

與免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，分子生物學(xué)方法通常更加敏感、特異，且同樣適宜于高通量檢測(cè)。OIE 在《陸生動(dòng)物診斷實(shí)驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》中推薦了PCR 檢測(cè)法，并常作為ASFV 檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者還進(jìn)行了線性指數(shù)PCR、數(shù)字PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增等方法的探索。

3.1 常規(guī)PCR 檢測(cè)法

基于凝膠電泳的常規(guī)PCR 檢測(cè)方法，其ASFV 最低檢出限多為幾十到上百拷貝的DNA。Agüero 等[10]基于VP72基因設(shè)計(jì)建立了常規(guī)PCR檢測(cè)方法，可以檢測(cè)到0.12 HAU50的ASFV 且具有良好的特異性，是目前OIE 推薦的PCR 檢測(cè)方法。羅玉子等[12]建立了改良的常規(guī)PCR 方法，其最低檢出限可達(dá)到60 拷貝，比OIE 推薦PCR 方法更加敏感。崔尚金等[11]建立了新型納米PCR 檢測(cè)方法，最低檢出限可達(dá)10 拷貝DNA。

除了單獨(dú)檢測(cè)ASFV 病原的PCR 方法，也有同時(shí)檢測(cè)多種豬病的多重PCR 方法的報(bào)道。Hu 等[14]建立了同時(shí)檢測(cè)鑒別ASFV、豬瘟病毒、高致病性藍(lán)耳病病毒、藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒的多重PCR 方法，其中ASFV 最低檢出限為1.50×103拷貝DNA。

3.2 熒光定量PCR 檢測(cè)法

與常規(guī)PCR 相比，熒光定量PCR 擴(kuò)增的基因片段更短，通常更加快速、敏感，最低檢出限可達(dá)幾個(gè)到幾十拷貝的DNA 模板；同時(shí)不需開(kāi)蓋，可減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能，是目前生產(chǎn)實(shí)踐中ASFV 檢測(cè)應(yīng)用最多的一類方法。

King 等[15]依據(jù)VP72基因建立了基于TaqMan探針的熒光定量PCR 方法，最低檢出限約為40 拷貝DNA，是目前OIE 推薦的檢測(cè)方法。Mckillen等[16-17]根據(jù)9GL基因設(shè)計(jì)引物，建立了基于MGB探針和分子信標(biāo)探針的熒光定量PCR 檢測(cè)方法，最低檢出限均達(dá)到20 拷貝DNA。Ronish 等[18]依據(jù)VP72基因建立了基于線性指數(shù)的PCR（linearafter-the-exponential PCR，LATE-PCR），最低檢出限可達(dá)到1～10 拷貝DNA。Fernández-Plinero 等[13]采用商品化通用探針庫(kù)中探針，結(jié)合VP72基因特異性引物，建立熒光定量PCR 方法，同時(shí)設(shè)置豬β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢出限為18 拷貝DNA。

根據(jù)探針標(biāo)記熒光基團(tuán)的不同，采用熒光定量PCR 方法也可實(shí)現(xiàn)多病原的同時(shí)檢測(cè)。Grau 等[19]建立了可從豬唾液樣品中同時(shí)檢測(cè)ASFV、豬瘟病毒、口蹄疫病毒3 種病原的熒光定量PCR 方法。

3.3 恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)是近年分子診斷研究熱點(diǎn)，具有兩方面突出優(yōu)勢(shì)：一是可以使用水浴設(shè)備在單一溫度下進(jìn)行等溫反應(yīng)，無(wú)需昂貴的熱循環(huán)設(shè)備，且反應(yīng)時(shí)間短；二是可通過(guò)在體系中添加的顏料色彩變化或是在試紙條上形成檢測(cè)線，直接肉眼判別結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

Hjertner 等[20]最早建立了ASFV 侵染檢測(cè)（invader assay）恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)能夠精確地定量DNA 和RNA 靶基因片段，檢測(cè)ASFV 最低檢出限為2 500 拷貝DNA，與豬瘟病毒無(wú)交叉反應(yīng)。雖然此技術(shù)敏感性低于其他分子檢測(cè)方法，但能夠檢測(cè)含有大量ASFV 的病死豬樣品。

James 等[21]建立了ASFV 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP），其最低檢出限為330 拷貝DNA。國(guó)內(nèi)學(xué)者江彥增等[22]、王彩霞等[23]、楊吉飛等[24]也建立了LAMP 檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限可達(dá)10 拷貝DNA。除了通過(guò)專用濁度儀生成曲線判定結(jié)果之外，LAMP 方法可通過(guò)在體系中添加鈣黃綠素等顏料，擴(kuò)增后利用顏色變化方便肉眼判讀結(jié)果。

李林等[25]建立了實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法。該方法在20 min 內(nèi)即可檢測(cè)16 拷貝DNA，且與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II 型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，為我國(guó)ASFV 臨床鑒別診斷、檢驗(yàn)檢疫和病原監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。Miao 等[26]結(jié)合應(yīng)用試紙條判定RPA 檢測(cè)結(jié)果，該方法可在10 min 內(nèi)檢測(cè)150 拷貝ASFV 的DNA，且與其他豬病無(wú)交叉反應(yīng)。

Fraczyk 等[27]建立了交叉引物擴(kuò)增方法（crosspriming amplication method，CPA），對(duì)VP72基 因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒最低檢出限達(dá)7.2 拷貝，同時(shí)可通過(guò)在反應(yīng)體系中添加SYBR Green I 染料，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)紫外光照射產(chǎn)生明亮的綠色熒光，肉眼判定結(jié)果。Gao 等[28]將CPA 技術(shù)與試紙條聯(lián)用，建立了ASFV 檢測(cè)方法，可檢測(cè)200 拷貝DNA，在臨床樣品的檢測(cè)中，與熒光定量PCR 方法符合率達(dá)97.4%（44/45）。

Wozniakowski 等[29]利用一種新型的聚合酶交叉螺旋反應(yīng)（polymerase cross-linking spiral reaction，PCLSR），檢測(cè)豬血中的ASFV 核酸，該方法可檢測(cè)7.2×102拷貝/μL 的VP72 質(zhì)粒模板，與豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

3.4 數(shù)字PCR 法

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是第三代PCR 技術(shù)，具有高靈敏度、高精確性、高耐受性、絕對(duì)定量等特點(diǎn)。鄔旭龍等[30]根據(jù)ASFVK205R基因設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物和TaqMan 探針，建立了ASFV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測(cè)方法。經(jīng)檢測(cè)，建立的ASFV 熒光定量PCR 和ddPCR 檢測(cè)方法線性關(guān)系較好（R2≥0.998），ddPCR 的最低檢出限可達(dá)到0.36 拷貝DNA，在20 μL 反應(yīng)體系中約為10 拷貝/反應(yīng)，具有很高的特異性和重復(fù)性，且不與其他常見(jiàn)豬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.5 生物傳感器法

Biagetti 等[31]基于DNA/LNA 探針與VP72靶基因保守區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，建立了ASFV 生物傳感器檢測(cè)方法。該方法最低檢出限為178 拷貝/μL 基因組DNA，定量限為245 拷貝/μL DNA，可一次性檢測(cè)40 份樣品，單次測(cè)試時(shí)間僅需要5 min。在ASFV 臨床感染樣品檢測(cè)中，與OIE 推薦的熒光定量PCR 方法具有極好的相關(guān)性。

3.6 原位雜交法

Ballester 等[32]使用原位雜交技術(shù)，用地高辛標(biāo)記的探針檢測(cè)福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFV 基因組DNA，并取得較好的檢測(cè)效果。

4 小結(jié)

目前，根據(jù)我國(guó)ASF 防控政策，ASFV 分離、鑒定工作僅能在許可的實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展。膠體金試紙條、ELISA等免疫學(xué)病原檢測(cè)方法，使用方便、快速，但受限于敏感性和特異性，目前主要應(yīng)用于急性發(fā)病或病死豬的快速診斷及群體篩查；分子生物學(xué)檢測(cè)方法仍是ASFV 病原檢測(cè)的主要手段，特別是熒光定量PCR 方法以其敏感、特異、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)在我國(guó)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。

應(yīng)用ASFV 分子生物學(xué)檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)注意如下兩方面：（1）分子檢測(cè)方法是對(duì)ASFV 基因組DNA 進(jìn)行檢測(cè)，因此當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，僅表示檢測(cè)樣品中存在病毒核酸，并不能說(shuō)明樣品中是否具有感染性的病毒粒子，如火腿、肉腸、血粉等產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)綜合考慮其加工工藝，也就是通過(guò)高溫煮熟、熏制等是否足以殺滅病毒。（2）應(yīng)注意分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在檢測(cè)過(guò)程中適當(dāng)增加對(duì)照及質(zhì)控樣品。分子檢測(cè)方法靈敏度較高，當(dāng)樣品處理時(shí)出現(xiàn)樣品間交叉污染，或是由于擴(kuò)增產(chǎn)物造成環(huán)境污染等，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；當(dāng)樣品腐敗變質(zhì)，或是在反應(yīng)體系中存在擴(kuò)增反應(yīng)抑制成分時(shí)，易造成結(jié)果的假陰性。

當(dāng)前，微流控、化學(xué)發(fā)光、基因芯片等新技術(shù)開(kāi)始不斷應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域，各種自動(dòng)化、一體化、便攜式或高通量設(shè)備不斷被研發(fā)，未來(lái)ASFV 病原學(xué)檢測(cè)將更加快速、準(zhǔn)確及自動(dòng)化，必會(huì)進(jìn)一步為ASF 防控提供有效支持。