郭書林，尤穎哲，陳何東，王藝紅，陳信忠，丁亦男，龔艷清，楊俊萍，陳長(zhǎng)樂，陳炳穎

（1.廈門海關(guān)，福建廈門 361016；2.漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建漳州 363000）

我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖已有很長(zhǎng)的歷史，但人工規(guī)?；B(yǎng)殖只有幾十年時(shí)間，其間因暴發(fā)性傳染病等原因，經(jīng)歷了從起始、興旺，到衰退和恢復(fù)的發(fā)展過程。其中，副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）被認(rèn)為是首要致病菌。2009 年，我國(guó)暴發(fā)一種對(duì)蝦疫病，隨后傳播到越南（2010 年）、馬來西亞（2011 年）、泰國(guó)（2012 年）。這些對(duì)蝦疫病的主要特征是急性肝胰腺壞死，發(fā)病階段為養(yǎng)殖早期的35 d 左右。2013 年，確定該病病原是某種細(xì)菌，初步確認(rèn)為一種VP，同時(shí)確定該病為急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）[1]。研究[2-3]報(bào)道，該種菌株因攜帶了一種130 kb 大小的毒力質(zhì)粒pVA1 而具有特殊的毒性，可以引起對(duì)蝦肝胰腺上皮細(xì)胞大量脫落等病理癥狀的急性肝胰腺壞死綜合征（acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS）。這種致病性VP 給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，但不會(huì)引起腹瀉。

生化鑒定和血清學(xué)分型是檢測(cè)鑒定細(xì)菌的經(jīng)典方法。PCR 技術(shù)通過對(duì)生物體的特異性RNA 或DNA 進(jìn)行識(shí)別，已被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物的病原檢測(cè)、鑒定。目前，一種AHPND PCR 檢測(cè)方法所用引物為AP3，其以一種毒力基因（序列分析顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)與細(xì)菌抗昆蟲毒素具有顯著的同源性）片段為擴(kuò)增靶標(biāo)，具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏性[4]。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是近年來發(fā)展起來的一種通過識(shí)別細(xì)菌表面蛋白的特異性而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速檢測(cè)鑒定的方法[5]。本試驗(yàn)通過生化鑒定、血清學(xué)分型、MALDI-TOF-MS 鑒定，以及以AP3 為引物的PCR 方法，分別對(duì)從福建省南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到的9 株VP 進(jìn)行檢測(cè)，比較各種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性、相關(guān)性，從而確定一種準(zhǔn)確快速檢測(cè)AHPNS 的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本處理

從福建省9 家規(guī)模化南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，各采集10 只患病幼蝦活體，共90 份樣本，取肝胰腺。

1.2 主要儀器

MALDI Biotyper 高通量微生物鑒定系統(tǒng)：德國(guó)Bruker Dahonics 公司生產(chǎn)，參數(shù)設(shè)置為線性操作模式、正離子、基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式，脈沖離子提取時(shí)間為100 ns，相對(duì)分子質(zhì)量為2～20 kD；VITEK-2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.3 主要試劑

VP 診斷血清：寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；VP 分離純化用培養(yǎng)基：青島海博公司產(chǎn)品；PCR mix 反應(yīng)液：天根生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR 引物：上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 弧菌分離 將1.1 中所述的90 份肝胰腺樣本，分別在TCBS 和弧菌顯色培養(yǎng)基平板中劃板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑單菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上劃線培養(yǎng)，編號(hào)備用。

1.4.2 生化鑒定 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上純化培養(yǎng)的菌落，用比濁儀將所檢測(cè)細(xì)菌濃度調(diào)整到0.5～0.63 麥?zhǔn)蠞岫?；利用VITEK-2 中的GN 卡，對(duì)VP 可疑菌株進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 MALDI-TOF-MS 鑒定 挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落于1.5 mL 離心管中，加入1 mL生理鹽水，混勻、離心，洗滌2 次；將清洗干凈的細(xì)菌加入300 μL 無菌水，混勻后加入900 μL 無水乙醇，混勻，室溫固定3～4 min，10 000 r/min離心2 min，棄上清；向沉淀中加入50 μL 70%甲酸，混勻后再加入50 μL 乙腈，混勻；室溫放置3～4 min，10 000 r/min 高速離心2 min，吸取上清點(diǎn)靶；點(diǎn)1 μL 上清于樣品靶盤上，同時(shí)點(diǎn)1 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液（校準(zhǔn)），待液體干后立即點(diǎn)1 μL 基質(zhì)溶劑。通過flexControl 軟件，采集數(shù)據(jù)圖譜；通過Biotyper 軟件對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析和鑒定。得分2.300～3.000，表示可完全達(dá)到鑒定到種的水平；得分2.000～2.299，表示可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平；得分1.700～1.999，表示有可能鑒定到屬的水平；得分0.000～1.699，表示沒有可信的鑒定結(jié)果。本研究均選取分值≥2.300 的結(jié)果作為待測(cè)樣本鑒定結(jié)果。

1.4.4 血清學(xué)鑒定 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.7—2013 的操作方法，使用抗O 和抗K 抗體，測(cè)定弧菌體（O）抗原和莢膜多糖（K）抗原血清型。

1.4.5 PCR 檢測(cè) 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，按照商品化核酸抽提試劑盒的操作方法提取 DNA，并以此作為PCR 檢測(cè)用模板。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3 上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL、TaqDNA 聚合酶0.5 μL、提抽物5 μL，加水補(bǔ)至25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 5 min，然后進(jìn)行32 次循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃5 min，4 ℃ 保溫。PCR 檢測(cè)通過引物AP3F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'（SEQ ID NO:1 ）和 AP3R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'（SEQ ID NO:2）擴(kuò)增質(zhì)粒pVA1 的基因片段，目的片段大小為336 bp。PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序、Blast 比對(duì)后，確定分離所得的菌株是否為引起AHPND 的VP 分離株。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離

將從福建省9 家規(guī)?；瘜?duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)采集的90份樣本，經(jīng)劃線分離培養(yǎng)后，從各樣本長(zhǎng)有可疑VP 菌落的TCBS 和弧菌顯色平板上，挑取≤5 個(gè)菌落進(jìn)行VITEK-2 生化鑒定。其中從6 家養(yǎng)殖場(chǎng)樣品中分離到VP 菌株數(shù)量分別是21、21、13、12、10 和4 株，總計(jì)81 株。從檢出VP 菌株數(shù)量≥13 的3 家養(yǎng)殖場(chǎng)中，分別隨機(jī)選取2 個(gè)樣本中的VP 分離株各1 株（共6 株）；從其余3 家養(yǎng)殖場(chǎng)，分別隨機(jī)挑取VP 分離株各1 株（共3 株）。以這9 株VP 分離株作為MALDI-TOF-MS 鑒定、血清學(xué)分型、PCR 檢測(cè)用樣本。

2.2 MALDI-TOF-MS 鑒定

對(duì)2.1 中所述的9 株VP 分離株進(jìn)行MALDITOF-MS 鑒 定。FT-18-1、FT-18-3、FT-18-4、XA-18-1 號(hào)分離株檢測(cè)得到的結(jié)果與VP 4a ISB 的匹配值分別為2.438、2.421、2.372、2.443；FT-18-2、XA-18-2、XA-18-3、XA-18-4、XA-18-5 號(hào)分離株檢測(cè)得到的結(jié)果與VP CCM5937 的匹配值分別為2.375、2.453、2.439、2.387、2.406；9 株分離株與MALDI-TOF-MS 中VP 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配值均大于2.300，表明鑒定結(jié)果可信度很高。

2.3 血清型測(cè)定

對(duì)9 株VP 分離株血清型進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)4 株為O1:KUT 血清型，3 株為O1:K68 血清型，2 株為O3:K6 血清型。其中：O1，菌體抗原為13 種血清群中編號(hào)為O1 的血清群；KUT，莢膜抗原的血清型不能分型；K68，莢膜抗原的血清型為65 種血清型中編號(hào)為K68 的血清型；O3，菌體抗原為13 種血清群中編號(hào)為O3 的血清群；K6，莢膜抗原的血清型為65 種血清型中編號(hào)為K6 的血清型。

2.4 PCR 檢測(cè)

對(duì)9 株分離株進(jìn)行PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4 株為引起AHPND 的VP 分離株，其余5 株未擴(kuò)增出目的片段，判為陰性。9 株菌株的血清學(xué)、MALDITOF-MS、VITEK-2 和PCR 鑒定結(jié)果見表1。

表1 9 株菌株的血清學(xué)、MALDI-TOF-MS、VITEK-2 和PCR 鑒定結(jié)果比較

3 分析與討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，MALDI-TOF-MS 鑒定方法對(duì)AHPND 的PCR 檢測(cè)呈陽(yáng)性和陰性的VP 均可以進(jìn)行菌種的準(zhǔn)確鑒定，且與經(jīng)典的VITEK-2 鑒定結(jié)果吻合，說明這種新發(fā)現(xiàn)的AHPND VP 變異株不影響MALDI-TOF-MS 菌種鑒定的準(zhǔn)確性。同時(shí)，MALDI-TOF-MS 技術(shù)較之于細(xì)菌生化鑒定方法更加簡(jiǎn)便快捷，在AHPND VP 菌株的分離鑒定中，可以提高檢測(cè)效率；將MALDI-TOF-MS 與PCR 檢測(cè)方法相結(jié)合，在AHPND 的病原學(xué)分析、流行病學(xué)調(diào)查以及診斷、監(jiān)測(cè)中可以取得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，引起AHPND 的VP 分離株血清型為O1:KUT 和O1:K68，結(jié)合Kongrueng 等[6]在其研究中測(cè)定到的AHPND VP 血清型包括O1:KUT、O1:K33 和O1:K68，可以看到所測(cè)定的AHPND VP 分離株均為O1 血清型，而K 抗原血清型至少有3 種。根據(jù)上述情況可以假設(shè)，由兩種情況導(dǎo)致AHPND VP 血清型不同[6]：一種假設(shè)是，最初1 個(gè)VP 克隆變異為AHPND VP，隨后變異為多種血清型的AHPND VP；另一種假設(shè)是，致病質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入了具有不同血清型的VP。因此目前分離到的AHPND VP 具有多種血清型。然而后一種假設(shè)很難解釋為什么沒有測(cè)定到除O1 血清型之外的AHPND VP。AHPND VP 是否在MALDI-TOF-MS測(cè)定中具有某些特征，還需要通過建立MALDITOF-MS 中大量AHPND VP 分離株分析結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)才能獲得。

4 結(jié)論

MALDI-TOF-MS 鑒定方法對(duì)這種新發(fā)現(xiàn)的AHPND VP 變異株可以進(jìn)行菌種鑒定，而且較之于細(xì)菌生化鑒定方法更加簡(jiǎn)便快捷；而將MALDITOF-MS 與PCR 方法相結(jié)合，可使AHPND 檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。