呂 婷， 周芬芬

艱難梭菌（Clostridioides difficile，原為Clostridium difficile）[1]為革蘭陽性專性厭氧菌，艱難梭菌感染（CDI）主要通過糞-口途徑傳播。正常腸道菌群可有效抑制艱難梭菌的繁殖，而抗菌藥物、免疫抑制劑等可破壞腸道菌群平衡[2-3]，使其定植并大量繁殖，并分泌毒素A （TcdA，308 kDa，由2 710個(gè)氨基酸組成）和/或毒素B（TcdB，270 kDa，由2 366個(gè)氨基酸組成）[4]，產(chǎn)生以腹瀉為主要表現(xiàn)的一系列臨床癥候群[5-6]。艱難梭菌是醫(yī)院感染性腹瀉中最常見的病原菌之一。2000年以來，隨著高毒力NAP1/BI/027株的出現(xiàn)和傳播，醫(yī)院獲得性CDI（HA-CDI）的發(fā)病率增長(zhǎng)了2.7倍[2-3]。以北美地區(qū)為例，HA-CDI所致的死亡率從＜1.5%增長(zhǎng)到4.5%～5.7%，在流行期間可以達(dá)到16.7%[7-8]。

人體CDI后，機(jī)體啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，前者得到了廣泛的研究，包括腸黏膜免疫反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的吞噬作用、氧化殺傷作用，以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的組織損傷和修復(fù)作用等；后者一般指T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)。目前適應(yīng)性免疫應(yīng)答研究仍主要關(guān)注于艱難梭菌TcdA和TcdB的抗體，包括IgA、IgM和IgG。T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究并不多。免疫反應(yīng)與CDI的定植、致病、治療和預(yù)后有著密不可分的關(guān)系。本文對(duì)CDI后機(jī)體出現(xiàn)的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答作一綜述。

1 固有免疫應(yīng)答

宿主天然免疫系統(tǒng)在抗CDI過程中發(fā)揮著重要的作用。CDI的早期階段主要是通過誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答。當(dāng)艱難梭菌進(jìn)入人體后，腸道內(nèi)的天然免疫物質(zhì)發(fā)揮即刻的免疫應(yīng)答，使腸道內(nèi)的抗菌肽類物質(zhì)，如防御素、內(nèi)源性抗菌肽、溶菌酶等發(fā)揮抗菌作用[9]。產(chǎn)生的毒素和定植因子也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。

1.1 毒素產(chǎn)生的固有免疫應(yīng)答

TcdA和TcdB主要由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：①N末端的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域（GTD）；②半胱氨酸蛋白酶區(qū)域（CPD）；③轉(zhuǎn)運(yùn)功能區(qū)TD（包含疏水區(qū)域）；④肽鏈C端可結(jié)合的重復(fù)寡肽序列CROP[10]。TcdA和TcdB的GTD結(jié)構(gòu)域可使Rho家族GTP酶（RhoA、Rac1和Cdc42）糖基化，引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重新分布和應(yīng)力纖維的丟失，導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞變圓、局部粘連解體和緊密連接的丟失[11-12]。TcdA和TcdB引起腸上皮細(xì)胞的破壞，使黏膜內(nèi)免疫細(xì)胞暴露，引起免疫反應(yīng)。

TcdA和TcdB通過激活細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）[13]和炎癥小體（inflammasome）[14]三種信號(hào)途徑在腸黏膜上皮細(xì)胞和固有層內(nèi)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞啟動(dòng)促炎性反應(yīng)，釋放大量細(xì)胞因子，招募以中性粒細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞到炎癥部位，清除細(xì)菌[15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與TcdA誘導(dǎo)的大鼠腸炎，后來進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TcdA可以引起線粒體膜電位的耗竭和ROS的釋放，線粒體定位和功能障礙出現(xiàn)在細(xì)胞變圓之前，提示TcdA對(duì)線粒體的損傷可能發(fā)生于細(xì)胞毒性的早期[18]。Kim 等[19]也發(fā)現(xiàn)受到TcdA感染結(jié)腸細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生ROS，進(jìn)而可以激活p38-MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致環(huán)氧化酶2（COX-2）的生成和前列腺素E2（PGE2）的分泌，從而上調(diào)IL-8基因的轉(zhuǎn)錄。在對(duì)腸神經(jīng)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TcdA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可降低細(xì)胞活性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且激活p38-MAPK信號(hào)通路刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生[20]。TcdB可以直接導(dǎo)致線粒體結(jié)合還原性輔酶（NADPH）復(fù)合體形成，產(chǎn)生的大量ROS直接促進(jìn)細(xì)胞壞死，這一過程是獨(dú)立于毒素的葡糖基酶作用的[21]。另外TcdA和TcdB可以激活機(jī)體的P38-MAPK、ERK1/2途徑和接下來的NF-κB途徑產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-23、IL-1β前體和IL-18前體[22]，TcdA通過激活絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，上調(diào)IL-8基因的轉(zhuǎn)錄[23]。此外，TcdA和TcdB通過使細(xì)胞Rho和Ras家族GTP酶糖基化，可激活胞內(nèi)感應(yīng)蛋白吡喃（pyrin）與銜接蛋白ASC、胱天蛋白酶前體（procaspase-1）共同構(gòu)成的吡喃炎癥小體，激活胱天蛋白酶-1（caspase-1），促進(jìn)IL-18和IL-1β從前體到成熟?；罨碾滋斓鞍酌?1可以促進(jìn)IL-1β、IL-18分泌[24-25]。Xu等[25]的研究發(fā)現(xiàn)TcdB激活的吡喃炎癥小體可以激活胱天蛋白酶-1，進(jìn)而激活消皮素D（gasdermin D），可引起細(xì)胞膜損壞，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡（pyroptosis）。TcdA和TcdB也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，毒素可順序激活胱天蛋白酶-3、8、9，引起人結(jié)腸上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞凋亡[17]。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡和焦亡是機(jī)體抗艱難梭菌侵襲的胞內(nèi)防御機(jī)制。

1.2 定植因子產(chǎn)生的固有免疫應(yīng)答

研究表明艱難梭菌可以定植在體外的類結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞和黏液分泌HT29細(xì)胞，可定植在小鼠盲腸、結(jié)腸及人的結(jié)腸上皮[26-28]。參與艱難梭菌定植的因素包括細(xì)胞壁蛋白（cell-wall proteins， CWP）、鞭毛（flagella）等[26，29]。

在C W P中，研究發(fā)現(xiàn)S層蛋白（S-l a y e r proteins，SLP）、黏附素66（adhesin Cwp66）以及Cwp84蛋白酶參與了艱難梭菌定植。SLP的前體蛋白SlpA（S-layer precursor）在Cwp84蛋白酶的作用下裂解成高度保守的高分子量SLP（high-molecular-weight SLP，HMW-SLP，也稱作P47）和菌株之間高度變異的低分子量SLP（low-molecular-weight SLP，LMW-SLP，也稱作P36），而后共同組裝成為SLP[30-32]。SLP可以激活巨噬細(xì)胞膜上的TLR4信號(hào)通路，釋放IL-6、IL-10、IL-12p40、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP-1α、MIP-2和單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）[33]。HMW-SLP可特異性錨定在人腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞壁上，而LMW-SLP作為菌體最外層的部分，其高度的序列變異性提示其可能與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)。Lynch等[33]對(duì)不同SLP序列的菌株對(duì)宿主反應(yīng)的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)含有高度slpA基因變異序列的核糖體核型（ribotype，RT） 027和RT078菌株比RT001和RT014菌株引起更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，不僅細(xì)胞因子表達(dá)升高而且巨噬細(xì)胞上的CD40、CD80和MHCⅡ表達(dá)也升高。

鞭毛也可介導(dǎo)艱難梭菌對(duì)黏膜細(xì)胞的黏附并參與黏膜免疫反應(yīng)。艱難梭菌鞭毛通過激活模式識(shí)別受體TLR5，激活NF-κB和MAPK信號(hào)途徑，促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-8、IL-22、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[34-35]。另有研究利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鞭毛和毒素引起的黏膜炎性反應(yīng)相互協(xié)同，鞭毛的敲除會(huì)降低小鼠炎性反應(yīng)的程度[36]。

1.3 固有免疫反應(yīng)的雙重作用

艱難梭菌可通過多種機(jī)制刺激機(jī)體釋放大量促炎因子和趨化因子，招募大量免疫細(xì)胞到感染部位，通過以中性粒細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞的吞噬作用，釋放抗菌肽、活性氮、ROS清除病原菌[18，37]，同時(shí)又產(chǎn)生炎癥相關(guān)的組織損傷。

CDI可以引起全身細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)產(chǎn)生，有些細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。研究表明IL-27與IL-27受體結(jié)合對(duì)CDI小鼠有保護(hù)作用[38]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/核轉(zhuǎn)錄因子（TGF-β/SMAD）信號(hào)通路保護(hù)小鼠免受TcdA導(dǎo)致的損傷[39]。IL-22為雙向性細(xì)胞因子，在不同組織、不同疾病狀態(tài)下例如肺、皮膚表現(xiàn)出復(fù)雜的生理作用，以肺組織為例，IL- 22在炎癥狀態(tài)下可以促進(jìn)促炎因子的表達(dá)，但在腸道中IL-22表現(xiàn)出對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用[40]。體外給予IL-22對(duì)CDI小鼠有保護(hù)作用。且發(fā)現(xiàn)與年輕小鼠相比，老年小鼠存在中性粒細(xì)胞的募集障礙，使體內(nèi)較少表達(dá)IL-22，CDI疾病更嚴(yán)重[41]。IL-22與IL-22受體的結(jié)合在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也被證明對(duì)小鼠具有保護(hù)作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制包括促進(jìn)上皮組織的再生，下調(diào)促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)腸道抗菌肽的分泌[42]，并且可以活化肺和肝臟的補(bǔ)體系統(tǒng)，清除易位的細(xì)菌等[43]。有研究發(fā)現(xiàn)CDI患者和CDI小鼠體內(nèi)IL-25的表達(dá)受到抑制。給予外源性IL-25可以降低CDI相關(guān)性死亡率和減輕組織損傷，這一作用是通過腸道嗜酸性細(xì)胞介導(dǎo)的[44]。另有研究認(rèn)為高水平表達(dá)的IL-5和 IFN-γ與輕度臨床表現(xiàn)和良好預(yù)后相關(guān)[45]。

某些細(xì)胞因子可以介導(dǎo)CDI的致病過程，加重腸道組織的損傷，例如IL-1β、IL-6、IL-8、IL- 16、IL-17A[45-46]、IL-23[47]、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）和趨化因子CXCL13[48-49]。Huang等[50]發(fā)現(xiàn)TcdA和TcdB均可誘導(dǎo)產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-A）作用于人腸道微血管上皮細(xì)胞，增加結(jié)腸血管通透性，有利于TcdA和TcdB的全身性傳播。艱難梭菌導(dǎo)致的腹瀉患者血清中MIF的水平明顯高于非艱難梭菌相關(guān)性腹瀉患者。同樣在小鼠模型中，CDI可增加血清中MIF水平，且清除體內(nèi)MIF后可明顯減輕艱難梭菌誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，降低死亡率。CXCL5 和IL-8 水平增高也可減緩CDI患者病情的康復(fù)。此外，IL-8 表達(dá)增多與CDI 復(fù)發(fā)增加相關(guān)，再次證明過度的免疫反應(yīng)會(huì)加重CDI病情[51-52]。有研究報(bào)道血清IL-2和IL-15的高表達(dá)與重癥CDI和不良預(yù)后有關(guān)。

2 適應(yīng)性免疫應(yīng)答

產(chǎn)毒艱難梭菌在腸道定植后，患者可出現(xiàn)無癥狀攜帶狀態(tài)。多項(xiàng)研究認(rèn)為可能與宿主啟動(dòng)針對(duì)TcdA和TcdB的體液免疫應(yīng)答有關(guān)。Mulligan等[53]發(fā)現(xiàn)無癥狀攜帶者血清中的抗體濃度明顯高于有癥狀的CDI患者，尤其是IgA和 IgM。另一研究也證實(shí)無CDI癥狀的住院患者血清中有更高水平的抗TcdA IgG抗體[54]。但也有研究結(jié)果與之相反。Johnson等[55]發(fā)現(xiàn)CDI患者血清中的抗TcdA IgG抗體更高。適應(yīng)性免疫應(yīng)答似乎直接決定艱難梭菌定植后疾病的走向。

2.1 體液免疫

在對(duì)CDI患者血清的檢測(cè)中可以發(fā)現(xiàn)抗TcdA和抗TcdB的IgA、IgG和IgM類抗體[56-57]，糞便中可以檢測(cè)抗TcdA和抗TcdB IgA類抗體。Viscidi等[58]報(bào)道在64%患者血清中檢測(cè)出抗TcdA抗體，66%患者血清中檢測(cè)出抗TcdB抗體。但多數(shù)研究報(bào)道抗艱難梭菌毒素抗體的檢出率并不高。Bacon等[59]檢測(cè)了185份血清，IgG-α TcdA陽性率為19.4%，IgG-α TcdB檢測(cè)陽性率為8.1%。另有研究對(duì)健康獻(xiàn)血者的400份血漿樣本的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)抗TcdA或抗TcdB抗體的陽性率為6%[60]。研究認(rèn)為黏膜免疫反應(yīng)針對(duì)的是腸毒素TcdA，產(chǎn)生IgA-α TcdA應(yīng)答。一旦細(xì)胞毒素TcdB入血，則可產(chǎn)生全身性IgG-α TcdB免疫應(yīng)答[60]。目前認(rèn)為高親和力的IgA和IgG可以中和毒素，介導(dǎo)對(duì)機(jī)體的保護(hù)[56]，但抗體效價(jià)與毒素中和能力并不呈正相關(guān)[60]，而IgM通常產(chǎn)生于免疫應(yīng)答早期，對(duì)毒素有著較低的親和力[61]。血清中抗TcdA和抗TcdB抗體與CDI的復(fù)發(fā)有關(guān)?？苟舅乜贵w水平越低，越容易復(fù)發(fā)[62]。Kyne等[63]發(fā)現(xiàn)患者初次感染艱難梭菌后，血清中的抗TcdA IgG抗體可減輕復(fù)發(fā)性CDI的臨床癥狀。

目前多項(xiàng)研究證實(shí)針對(duì)TcdB的特異性人源性單克隆抗體bezlotoxumab（BEZ）對(duì)高?；颊邚?fù)發(fā)性CDI預(yù)防可取得良好效果[64-65]。bezlotoxumab和actoxumab已經(jīng)完成三期臨床試驗(yàn)MODIFYⅠ和MODIFYⅡ，結(jié)果顯示單獨(dú)應(yīng)用bezlotoxumab可以降低CDI的復(fù)發(fā)率，單獨(dú)應(yīng)用actoxumab時(shí)復(fù)發(fā)性CDI的發(fā)生率與安慰劑組并無差異，而聯(lián)合應(yīng)用bezlotoxumab和actoxumab可以顯著降低復(fù)發(fā)性CDI的發(fā)生率[66]，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2016年正式通過bezlotoxumab的上市要求，主要用于18歲及以上的患者，發(fā)生復(fù)發(fā)性CDI的高危人群，可降低復(fù)發(fā)性CDI發(fā)生率[67]。

在CDI患者血清中也檢測(cè)到了針對(duì)定植因子的抗體，包括SLP的IgG抗體，Cwp66、蛋白酶Cwp84以及鞭毛蛋白FliC和FliD的抗體[68]。研究發(fā)現(xiàn)CDI患者血清中的SlpA抗體高于正常人群。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)給小鼠和倉鼠直腸注射純化蛋白SlpA可引起全身性和局部性體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生IgG和IgA抗體，能減少艱難梭菌在小鼠腸道中定植，并在致死性倉鼠模型中具有部分保護(hù)作用[69]。且有研究報(bào)道初發(fā)艱難梭菌感染患者血清中的抗SlpA IgG抗體水平顯著高于復(fù)發(fā)患者[70]。Cwp66的錨定區(qū)N末端和高度可變區(qū)C末端均具有免疫原性，Péchiné等[68]在對(duì)CDI患者和健康人的血清中均檢測(cè)到了Cwp66兩端的抗體，但C端抗體效價(jià)明顯高于N端，提示C末端具有更強(qiáng)的免疫原性。也有研究以灌胃、直腸給藥、皮下注射Cwp84免疫倉鼠，在倉鼠血清中檢測(cè)出抗體，并且直腸免疫Cwp84組的艱難梭菌的腸道定植率相比未免疫組降低了26%，倉鼠存活率為33%高于未免疫組[71]。另有研究發(fā)現(xiàn)用鞭毛蛋白FliC免疫小鼠可顯著降低艱難梭菌的定植，對(duì)CDI小鼠的保護(hù)可以達(dá)到80%[72]。

2.2 細(xì)胞免疫

迄今為止，關(guān)于CDI的大多數(shù)研究還僅局限于抗體和B細(xì)胞的研究，對(duì)于T細(xì)胞在CDI中的作用還知之甚少，但是在對(duì)免疫功能受損患者CDI流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞免疫缺陷患者（HIV感染、實(shí)體器官移植后）CDI的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于正常人群，以肺移植為例，CDI發(fā)病率可高達(dá)23%，CDI的復(fù)發(fā)率在以肺移植為代表的實(shí)體器官移植中可高達(dá)40%[73]。

T細(xì)胞免疫應(yīng)答與機(jī)體的固有免疫應(yīng)答是互相聯(lián)系、相互作用的。目前關(guān)于適應(yīng)性免疫應(yīng)答小鼠方面的研究認(rèn)為T細(xì)胞可以輔助機(jī)體B細(xì)胞免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答，CD4+T細(xì)胞向B細(xì)胞活化提供信號(hào)，幫助抗體類別轉(zhuǎn)換、親和力提高和記憶細(xì)胞的形成，驗(yàn)證了抗毒素抗體的產(chǎn)生需要T細(xì)胞的輔助[74]。在對(duì)固有免疫應(yīng)答研究中發(fā)現(xiàn)，CDI中高表達(dá)的IL-1β可作為Th17的分化因子，介導(dǎo)強(qiáng)有力的Th17免疫應(yīng)答，分泌IL-17作用于CDI的發(fā)病過程中[75-76]。有研究報(bào)道將Th17細(xì)胞接種至小鼠體內(nèi)，IL-17水平升高，導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性死亡率增加。Th17細(xì)胞軸分泌的細(xì)胞因子IL-6和IL-23與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。人體感染艱難梭菌后，血清中IL-6水平越高，患者的死亡率越高。因此認(rèn)為Th17細(xì)胞在CDI的致病機(jī)制中起著重要的作用。也成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[77]。IFN-γ作為Th1的分化因子，介導(dǎo)的Th1型免疫應(yīng)答可以保護(hù)機(jī)體，當(dāng)Th1型免疫應(yīng)答向Th2或者是Th17轉(zhuǎn)變時(shí)，提示CDI疾病程度加重[45]。從目前的研究報(bào)道來看，T細(xì)胞免疫也同樣存在雙重作用。

3 結(jié)語

固有免疫應(yīng)答和體液免疫、細(xì)胞免疫彼此相互連接，構(gòu)成復(fù)雜的防御網(wǎng)絡(luò)應(yīng)對(duì)CDI。本文討論了艱難梭菌感染宿主后所引起的免疫反應(yīng)，可以看出目前對(duì)CDI的認(rèn)知不僅僅關(guān)注艱難梭菌本身，更應(yīng)關(guān)注艱難梭菌與宿主的相互作用，宿主免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱影響著患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。對(duì)于艱難梭菌與宿主之間相互作用的研究將為新治療方法和預(yù)防措施的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和研究方向。