柳榮，申睿，朱向東，高艷奎，王歡，鐘興騰

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以大腸(結(jié)腸與直腸)黏膜與黏膜下炎癥為主要特征的慢性非特異性炎癥性疾病，其病因病機(jī)尚不明確。目前本病病因、病機(jī)尚不夠明確，其病程漫長，常反復(fù)發(fā)作，為現(xiàn)代難治病之一。臨床研究表明[1]，心理社會(huì)因素的應(yīng)激可引起胃腸道功能紊亂，約有74%UC患者認(rèn)為，社會(huì)心理因素對(duì)UC有很大影響[2]。也有學(xué)者認(rèn)為[3]情志因素為炎癥性腸病復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而與之密切相關(guān)的肝郁脾虛證是UC的主要證型之一。中醫(yī)藥治療UC具有廣闊的前景，借助于動(dòng)物模型的間接研究，可以排除很多干擾因素，并且更有效地認(rèn)識(shí)UC的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，同時(shí)也避免了人體實(shí)驗(yàn)造成的傷害，但目前肝郁脾虛型UC動(dòng)物模型的建立尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，選擇建立正確合理的動(dòng)物模型，探討其病因病機(jī)以及中醫(yī)藥應(yīng)用等具有重要意義。目前肝郁脾虛型UC動(dòng)物模型的建立方法有單純理化因素造模，單純中醫(yī)理論造模和病證結(jié)合造模，現(xiàn)將近年來關(guān)于肝郁脾虛型UC大鼠模型的研究進(jìn)展綜述如下。

1 單純化學(xué)藥物模型—CCl4注射法

二十世紀(jì)70年代末期湖南醫(yī)科大第一附院的陳國楨等[4]最早用CCl4建立了小鼠慢性中毒的肝郁脾虛證模型。CCl4為有毒物質(zhì)，可損傷肝、脾、腎、胰、腸等多臟器。據(jù)研究表明[4]，當(dāng)慢性CCl4中毒時(shí)，腸黏膜表層出現(xiàn)潰破，固有膜內(nèi)有明顯水腫及炎細(xì)胞浸潤，微絨毛因水腫而肥大變短，故此法理論上適用于建造肝郁脾虛型UC模型。造模方法為：取雄性大鼠，皮下注射10%CCl4花生油溶液，5 mL/kg，每周2次，共4周，首次劑量加倍。

CCl4注射法造模僅使用理化刺激建立模型，僅片面的造成大鼠大腸、肝臟、脾臟等的損傷，片面的將肝臟、脾臟損傷視為肝郁脾虛是十分荒謬的，其忽視了中醫(yī)整體觀念，錯(cuò)誤的將中醫(yī)肝脾與西醫(yī)肝臟、脾臟混為一談，故其模擬出的動(dòng)物模型很難真實(shí)地反應(yīng)中醫(yī)證候特點(diǎn)。此外，此模型制作2年后，實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟仍有結(jié)節(jié)、假小葉存在，對(duì)UC模型來說干擾因素極大。此法近年來已經(jīng)很少有人使用。

2 束縛式模型

UC的病因至今仍不明確，其心理因素在疾病產(chǎn)生、惡化中具有重要地位。束縛式動(dòng)物模型為肝郁脾虛型動(dòng)物模型中最為常見的造模方式，將動(dòng)物進(jìn)行捆綁，從而使其肝氣郁滯，情志不暢，進(jìn)而引起精神抑郁；氣郁化火，肝失柔順之性，則急躁易怒；肝氣橫逆犯脾，脾氣虛弱，不能運(yùn)化水谷，則食少腹脹；氣滯濕阻，則腸鳴矢氣，便溏不爽，或溏結(jié)不調(diào)；肝氣犯脾，氣機(jī)郁結(jié)，運(yùn)化失常，故腹痛則瀉。

2.1 單純束縛模型

單純束縛模型現(xiàn)有四肢捆綁束縛[5]、模具束縛等[6-7]方法，束縛時(shí)間為7～21 d[5-7]，以21 d最為常見，每日束縛時(shí)間為3～8 h不等，以8 h為最常見。此種模型采用束縛激怒大鼠使大鼠肝脾功能失調(diào)、脾虛肝郁，此方法符合中醫(yī)整體觀念，但此種造模方式的穩(wěn)定性、可靠性和可重復(fù)性差。經(jīng)過束縛引起致病的強(qiáng)度、病程持續(xù)時(shí)間以及大鼠的個(gè)體耐受度差異使此模型難以進(jìn)行統(tǒng)一化處理，并且大鼠模型的自然恢復(fù)速度極快，造模不可控因素較多，難度大。且此方法主要針對(duì)制造肝郁脾虛證型模型，其對(duì)是否成功制造UC模型無可靠性依據(jù)和穩(wěn)定性。

2.2 限制活動(dòng)+限制飲食+三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌腸模型

TNBS是一種半抗原物質(zhì)，與大分子組織蛋白結(jié)合后成為一種抗原物質(zhì)，引起體內(nèi)免疫機(jī)能反應(yīng)進(jìn)而誘發(fā)腸道炎癥。乙醇可刺激并損傷結(jié)腸黏膜，使黏膜屏障遭到破壞。造模方法：大鼠禁食后麻醉，從肛門插入導(dǎo)管深6～8 cm后，注入100 mg/kgTNBS+ 50%的乙醇0.25 mL的混合溶液，倒置30 s。此法可造成1～2周左右的炎癥[8]。此種造模方式目前可見兩種，一種于限制飲食限制活動(dòng)整體結(jié)束后進(jìn)行TNBS/乙醇混合液灌腸造模，邱家權(quán)[9]、程小麗[10]、曹燕飛[11]等采用此方法造模，此方法限制飲食限制活動(dòng)時(shí)間為2～3 w[9-11]，以3 w為常見。另一種為先限制飲食限制活動(dòng)，1 w后進(jìn)行TNBS/乙醇混合液灌腸造模，然后再進(jìn)行2 w限制飲食限制活動(dòng)造模。谷松[12]、毛穎[13]、秦震聲[14]、王軼[15]等均采用此種方法造模，造模過程中大鼠逐漸出現(xiàn)胡須下垂、扎堆、懶動(dòng)、飲食減少、細(xì)聲尖叫、毛少光澤等肝郁脾虛證癥狀。

此種模型為病證結(jié)合動(dòng)物模型，其具有中醫(yī)病因病理理論依據(jù)，且在其模型建立后可通過動(dòng)物體表特征、活動(dòng)、大小便形態(tài)等評(píng)價(jià)模型，判斷其是否符合中醫(yī)證候特點(diǎn)，彌補(bǔ)了中醫(yī)傳統(tǒng)病因致病的模糊性，加強(qiáng)了模型的可重復(fù)性和模型建立的可靠性。該模型的建立操作簡單，可重復(fù)性高，且對(duì)動(dòng)物性的傷害性較低，成功率高，是目前最常用的UC動(dòng)物模型之一，適合UC免疫學(xué)角度的研究[16]。

2.3 限制活動(dòng)+限制飲食+乙酸灌腸模型

上世紀(jì)70年代開始有學(xué)者運(yùn)用乙酸建立大鼠 UC 模型。乙酸呈弱酸性，能增加血管通透性、促進(jìn)纖維蛋白水解、干擾凝血、損傷腸道黏膜，引起炎癥反應(yīng)[17]。具體方法[18]：大鼠禁食后麻醉，倒立后從肛門插入導(dǎo)管注入4%～5%乙酸溶液15～30 s后，注入0.9%氯化鈉溶液沖洗3次。并配合束縛刺激每天約8 h，連續(xù)3 w合并飲食失節(jié)法復(fù)制中醫(yī)證與西醫(yī)病相結(jié)合的肝郁脾虛型UC大鼠模型[19-23]。實(shí)驗(yàn)后動(dòng)物出現(xiàn)糞便溏瀉、腎上腺重量增加、胸腺重量下降、便血、喜扎堆、體重減輕、食欲下降等癥狀。乙酸模型操作簡單，可重復(fù)率高，短期內(nèi)可出現(xiàn)明顯癥狀，適用于急性炎癥、炎癥介質(zhì)、致炎機(jī)理及中藥抗炎機(jī)理的研究，此方法在實(shí)驗(yàn)性UC模型的建立中應(yīng)用非常廣泛。但由于此模型致病因素單純，乙酸刺激大腸僅可導(dǎo)致腸道表面損傷，與臨床致病因素有較大差異，且此種損傷容易自愈，并不適用于觀察病程長的實(shí)驗(yàn)。

2.4 限制活動(dòng)+限制飲食+免疫致敏+局部乙酸刺激模型

此模型的原理主要是在結(jié)腸局部發(fā)生阿瑟氏(Arthus)反應(yīng)[24]，為實(shí)驗(yàn)性局部過敏反應(yīng)，可使局部出現(xiàn)水腫、出血和壞死等劇烈的炎癥反應(yīng)。造模方法[20,23,25-28]：取大鼠的結(jié)腸黏膜組織加福氏佐劑制成免疫制劑。于第1、7、14、21天分別于足跖內(nèi)注射抗原4 mg(末次注射不加佐劑)。并于第1、7、14、21天用20%烏拉坦4 mL/kg麻醉大鼠后，用導(dǎo)管插入大鼠肛門注入5%醋酸1 mL，用乙酸誘導(dǎo)結(jié)腸潰瘍。同時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行限制活動(dòng)及限制飲食，每天約8 h，連續(xù)3 w，造成肝郁脾虛型UC大鼠模型。本法重復(fù)性好，是外源物質(zhì)引起宿主反應(yīng)、基因和免疫影響三者相互作用的結(jié)果，可以較好地模擬人類UC病變的慢性活動(dòng)性特點(diǎn)，并可產(chǎn)生與人類UC較為接近的臨床癥狀及腸道病變，且此種造模方法不易自愈，可以進(jìn)行周期較長的實(shí)驗(yàn)。但此方法需要一定的設(shè)備、條件及掌握熟練的技術(shù)[16]。

3 夾尾法急性激怒模型

夾尾法其原理與束縛法一致，通過止血鉗夾尾激怒大鼠從而使其急躁易怒，肝氣橫逆犯脾，氣機(jī)郁結(jié)，運(yùn)化失常，腹痛而泄瀉。

3.1 夾尾法急性激怒+限制飲食模型

歐陽河泉[29]認(rèn)為心理、精神的不良應(yīng)激和不良飲食習(xí)慣是影響胃腸道功能異常的主要病因。造模方法:每日用長海綿鑷子隔雙層紗布鉗夾鼠尾末端1/3處[30]或用塑料夾夾住鼠尾[31]，使其暴怒掙扎，并與其他大鼠持續(xù)廝打30 min，每日1～2次[30-32]；同時(shí)給予隔日進(jìn)食，模擬饑飽失常。連續(xù)2 w后出現(xiàn)毛發(fā)枯黃變暗、飲食量減少、體質(zhì)量減輕、大便稀溏、伴易怒或抑郁狀態(tài)，提示造模成功。止血鉗夾尾激怒法相對(duì)較為符合肝郁脾虛證的中醫(yī)病因病機(jī)，但其反映的只是在應(yīng)激狀態(tài)下的病理，其引發(fā)的大鼠受到刺激后的時(shí)間及程度都不能進(jìn)行系統(tǒng)量化，是否達(dá)到“怒傷肝”的程度也無法確定，且此種病理狀態(tài)自然恢復(fù)快，故此方法所造動(dòng)物模型的穩(wěn)定性、可靠性和可重復(fù)性差。

3.2 夾尾法急性激怒+限制飲食+限制活動(dòng)+TNBS/乙醇溶液灌腸模型

胡政[33]采用TNBS/乙醇溶液灌腸+限制飲食+限制活動(dòng)+夾尾法急性激怒法制作肝郁脾虛型UC大鼠模型。具體方法：將大鼠進(jìn)行四肢束縛，同時(shí)限制飲食，每天9 h，配合間斷性夾尾刺激，每次10 min，每天4次。2周后，進(jìn)行TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL)灌腸。造模后大鼠皮毛稀疏無光澤、喜扎堆貼邊、反應(yīng)遲緩、大鼠飲食量減少、體重減輕、易激怒等現(xiàn)象。此造模方法較前法具體全面，但操作較為復(fù)雜，制作模型時(shí)動(dòng)物差異性較大，穩(wěn)定性、可靠性和可重復(fù)性差。

4 游泳疲勞+限制飲食+限制活動(dòng)模型

此方法根據(jù)中醫(yī)病因發(fā)病學(xué)原理，采用慢性束縛應(yīng)激法建立肝郁證模型并采用過度勞累加饑飽失常法建立脾虛證模型，復(fù)制中醫(yī)肝郁脾虛證大鼠模型[34]。此造模方法目前有兩種方式，第一種[34-35]為：每日將大鼠置于盛有溫水(22±1)℃的大塑料桶中游泳10～20 min，限制自由活動(dòng)3 h，在此基礎(chǔ)上可增加夾尾30 min、搖晃5 min[35]。配合隔日喂食，連續(xù)3 w。第二種[36]為：山西白醋灌胃20 mL/kg，然后把大鼠放入特制鐵筒中限制活動(dòng)，使大鼠在水中站立，劍突以下浸人水中4 h，水溫控制在(20±2)℃，1次/d，連續(xù)造模10 d。此方法，第一種較為常見，但其游泳疲勞時(shí)間較短，并且為單純中醫(yī)病因復(fù)合因素模擬建模，造模具有半真實(shí)性和抽象性。第二種為中西醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型，且浸泡站立疲勞時(shí)間較久，但此方式操作具有設(shè)備條件限制性，且白醋灌胃對(duì)胃腸的刺激受動(dòng)物自我恢復(fù)性影響，適用于短期實(shí)驗(yàn)，不適用于長期藥理療效觀察。

5 苦寒瀉下法

中醫(yī)認(rèn)為，過用苦寒，久之損傷脾陽。研究發(fā)現(xiàn)[37]，脾虛證與胃腸道功能、胃腸道激素、胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，免疫學(xué)改變，神經(jīng)、內(nèi)分泌、微量元素改變等均有聯(lián)系。長期服用大黃、番瀉葉等苦寒藥物亦可導(dǎo)致免疫指標(biāo)的下降[38]。

5.1 苦寒瀉下+限制飲食+限制活動(dòng)模型

本法苦寒瀉下，損傷脾陽，配合束縛激怒大鼠，以及饑飽失常多因素造模，屬復(fù)合因素模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因建立動(dòng)物模型。造模方法[39-41]：將大鼠實(shí)驗(yàn)前10～12 h禁食不禁水，分別予以0.4 g/mL番瀉葉煎劑灌胃，給藥體積10 mL/kg，每日1次，合并束縛其上肢及肩背胸腹部，限制大鼠搔抓頭面部，但不限制其活動(dòng)，束縛時(shí)間為1 h，連續(xù)3 w。此法符合中醫(yī)病因病理，但UC的最典型臨床表現(xiàn)為排出帶有血、膿和黏液的糞便，此方法造模后出現(xiàn)稀便，但極少伴有血、膿。

5.2 苦寒瀉下+夾尾急性激怒法模型

此法采用夾尾刺激急性激怒大鼠，“怒傷肝，久則郁”，使之肝氣橫逆犯脾，氣機(jī)失常而致泄瀉。具體方法[42]：用止血鉗夾住大鼠的尾巴，每次刺激30 min，3次/日，令大鼠相互撕咬、打斗，3 d后開始用大黃灌胃1.5 mL/2次，夾尾改為2次/d，15 min/次，夾尾與灌胃同時(shí)進(jìn)行共10 d，期間配合隔日進(jìn)食。造模后，大鼠出現(xiàn)飲食減少、體質(zhì)量減輕、扎堆、倦臥、毛發(fā)枯亂、淡漠、易暴躁、肛門污穢等肝郁脾虛癥狀。此法使用苦寒瀉下藥物通常為大黃、番瀉葉，有研究顯示[38]，番瀉葉瀉下效果比大黃強(qiáng)，且大黃在產(chǎn)生瀉下作用后又可出現(xiàn)便秘。大黃、番瀉葉均可使免疫指標(biāo)下降，但大黃內(nèi)還含有增強(qiáng)免疫力等的有效成份，能與令機(jī)體暫時(shí)出現(xiàn)免疫力下降的有效成份相對(duì)峙，而番瀉葉純?yōu)a無補(bǔ)，可以作為苦寒瀉下藥物的首選。

6 電擊法+限制飲食+乙酸灌腸模型

電擊可對(duì)動(dòng)物造成強(qiáng)烈刺激，使其郁怒傷肝，長期飲食失節(jié)可致動(dòng)物脾虛，再結(jié)合乙酸灌腸可復(fù)制中醫(yī)“證”與西醫(yī)“病”相結(jié)合的大鼠肝郁脾虛型UC模型。張芳艷等[43]將大鼠放入電擊籠中，電壓為20～30 V，每日電擊2次，每次20 min，配合飲食失節(jié)，連續(xù)3 w，然后用乙酸灌腸誘導(dǎo)結(jié)腸潰瘍，制備大鼠肝郁脾虛型UC模型。此法對(duì)設(shè)備等條件要求很高，使用者較少，且電擊對(duì)動(dòng)物刺激過于強(qiáng)烈，無法把握僅激怒大鼠，長期不定時(shí)刺激可能會(huì)造成動(dòng)物恐懼，“恐傷腎”，可影響導(dǎo)致其他證候產(chǎn)生。

7 子母分離應(yīng)激+限制活動(dòng)+限制飲食模型

研究表明[44]哺乳期母子分離會(huì)導(dǎo)致小鼠腦組織抗氧化酶基因、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因、糖皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)量下調(diào)以及蛋白氧化損傷，進(jìn)而影響腦組織正常功能。使小鼠成年后抗抑郁能力降低，當(dāng)受到外界慢性應(yīng)激刺激處理時(shí)，容易產(chǎn)生抑郁樣行為。此法運(yùn)用精神-神經(jīng)-外周刺激三種因素復(fù)合造模法構(gòu)建肝郁脾虛證大鼠模型。具體造模方法[45-46]：實(shí)驗(yàn)用幼年SD大鼠從出生第2天起開始造模，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，將乳鼠取出單獨(dú)小籠飼養(yǎng)兩周，每天2～3 h，配合直腸灌注0.5%的醋酸每次0.4 mL/d。然后束縛大鼠上肢及肩胸部，束縛時(shí)間為2～3 h/d，束縛2 w，不限活動(dòng)，期間進(jìn)行單獨(dú)分離飼養(yǎng)。模型建立后依靠動(dòng)物表征評(píng)價(jià)、動(dòng)物證候評(píng)價(jià)等評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)模型，判斷模型建立是否成功。

8 孤養(yǎng)+限制活動(dòng)+限制飲食模型

研究表明[47]，孤養(yǎng)可導(dǎo)致大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)、中樞5-HT功能低下，出現(xiàn)抑郁和焦慮樣行為。郭建麗等[48]采用孤養(yǎng)配合限制飲食、限制活動(dòng)的方法，將大鼠放入自制籠中，限制其自由活動(dòng)，每籠1只孤養(yǎng)，每天束縛6 h。每周給大鼠不定時(shí)的禁食2次，造模時(shí)間3 w。造模后通過實(shí)驗(yàn)性肝郁脾虛癥狀、體征和相關(guān)指標(biāo)測試，判斷造模是否成功。

子母分離和孤養(yǎng)這兩種造模方法，都有其獨(dú)特的理論依據(jù)，但這兩種方法其概念自身具有模糊性，造模時(shí)施加病因的可控性差，且受個(gè)體差異性影響較大。

9 小結(jié)

近年來制備中醫(yī)動(dòng)物模型的方法越來越多，為開展研究提供了很多途徑。但中醫(yī)動(dòng)物模型的制備成功與否一直備受爭議，還存在不少問題。以上造模方法大致可分為三類，單純理化因素造模方法，單純中醫(yī)理論造模方法和病證結(jié)合造模方法。首先，單純理化因素造模方法僅使用理化因素刺激，造成動(dòng)物肝臟、脾臟、大腸的損傷，將中醫(yī)肝脾與西醫(yī)肝脾混為一談，并完全忽視了造成中醫(yī)病證的病因病機(jī)，此種造模方法不符合中醫(yī)整體觀念。其次，單純中醫(yī)理論施加因素造模方法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)但也存在不容忽視的缺陷，中醫(yī)是以人為整體，肝郁脾虛證型的制備均與刺激情志相關(guān)，但人和動(dòng)物的情感并不能達(dá)到完全同一性，故其具有半真實(shí)性和抽象性，且中醫(yī)動(dòng)物模型的穩(wěn)定性、可靠性和可重復(fù)性較差。最后，病證結(jié)合造模方法既符合中醫(yī)病因病理，又符合西醫(yī)疾病模型的建立，具有單純理化因素模型和單純中醫(yī)理論模型所不具有的優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)該注意的是，目前認(rèn)為UC的發(fā)病是外源物質(zhì)引起宿主反應(yīng)、基因和免疫影響三者相互作用的結(jié)果，其病程漫長，常反復(fù)發(fā)作，而TNBS/乙醇溶液灌腸模型和乙酸灌腸等模型僅利用理化因素直接刺激，造成腸黏膜及血管損傷，其病程維持時(shí)間短，且與臨床病因病機(jī)及疾病過程差異較大。因此，探討UC發(fā)病的病因病機(jī)，建立系統(tǒng)合理的中醫(yī)評(píng)價(jià)體系，尋找特異性指標(biāo)已刻不容緩。

綜上所述，束縛法對(duì)大鼠情志的影響已有較多人研究證實(shí)，其配合飲食失節(jié)刺激，所制成的肝郁脾虛證型模型相較于其他方法有更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。免疫復(fù)合法模型體現(xiàn)了腸道黏膜損害與免疫失調(diào)這兩個(gè)與人UC相似度極高的病理特征，造模后病程持續(xù)時(shí)間較長。筆者認(rèn)為，束縛法結(jié)合飲食失節(jié)法結(jié)合免疫復(fù)合法是現(xiàn)階段一種較為符合肝郁脾虛型UC病理特征的造模方法。隨著科技的進(jìn)步和對(duì)中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)更深入的探索，對(duì)UC基因、免疫等更深入的研究將為建立理想的UC模型奠定基礎(chǔ)，為解決UC這一世界難治病提供更好的條件。