王悅縈，李方琳，粟雨芯，李凌浩，馬忠仁

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

細(xì)胞自噬與凋亡同時(shí)參與細(xì)胞損傷時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)，并受到嚴(yán)格的基因?qū)用娴恼{(diào)控[1-3]。自噬相關(guān)蛋白不僅可以參與自噬的重要功能來(lái)調(diào)控病毒的入侵，而且還能作用于天然免疫信號(hào)通路來(lái)調(diào)控病毒的入侵及復(fù)制，而自噬小體從形成到降解的整個(gè)過(guò)程中是ATG蛋白的直接參與和調(diào)控[4-6]。

ATG是一組進(jìn)化保守的基因，參與自噬過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)到液泡的運(yùn)輸過(guò)程[7]。Atg13最初作為一種結(jié)構(gòu)性表達(dá)蛋白在酵母中被發(fā)現(xiàn)，該蛋白在基因?qū)用媾c Atg1 相連，后者是自噬所需的一種蛋白激酶。自噬過(guò)程需要 Atg1 與 Atg13 之間的直接結(jié)合。由于ATG13蛋白在細(xì)胞自噬的起始階段起關(guān)鍵的作用，所以本研究選取了牛的autophagy related gene 13（ATG13）為研究對(duì)象[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 感受態(tài)細(xì)胞DH5α、牛腎細(xì)胞（Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK）由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心保存、原核表達(dá)菌株 BL21 (DE3)為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pGEX-6P-1質(zhì)粒由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 2×Ex Taq Master Mix、DL2000、T4 ligase；Blueplus II Protein Marker；IPTG 、GST標(biāo)簽抗體、山羊抗小鼠抗體，購(gòu)自sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 從Genbank中找到ATG13全基因序列，使用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增ATG13的編碼基因。引物序列如下：

ATG13-BamHI-F：5′ -CGGGATCCATGG AAACTGATCTTAATTCCCAGGACA-3′

ATG13-XhoI-R：5′-CCCTCGAGTTACTG CAGGGTTTCTACAAAGGCA-3′

該引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1 440 bp。

1.2.2 ATG13的編碼基因的擴(kuò)增與克隆 由MDBK細(xì)胞中獲取ATG13編碼基因，PCR擴(kuò)增基因。使用One Step RT-PCR Kit Ver.2進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的基因片段。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 BamHI和Xho I雙酶切ATG13基因片段和pGEX-6P-1；瓊脂糖凝膠電泳并回收目的基因和線性化的pGEX-6P-1載體。將回收的ATG13基因片段與線性化的pGEX-6P-1載體用T4連接酶于16℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單克隆菌落放大培養(yǎng)，BamHI和Xho I雙酶切鑒定并命名為pGEX-6P-1-ATG13，-20℃保存，備用。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)載體命名為pGEX-6P-1-ATG13，將其轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到10 ml新鮮LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，在誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。收集誘導(dǎo)后菌體，經(jīng)超聲破碎后，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組蛋白的Western blot分析 將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，與稀釋于5% BSA 的ATG13單抗4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜。再與稀釋于5% BSA的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG室溫下孵育2 h，TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果及重組原核表達(dá)載體的鑒定

經(jīng) PCR擴(kuò)增得到的目的片段大小約1 440 bp，與預(yù)期大小相符（圖1）。重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-ATG13經(jīng)BamHI和 Xho I雙酶切，電泳后出現(xiàn)1 440 bp的目的條帶，證明重組表達(dá)構(gòu)建結(jié)果成功（圖2）。

圖1 ATG13基因的擴(kuò)增

圖2 ATG13重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

2.2 重組蛋白的Western blot分析

將pGEX-6P-1-ATG13轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中并制成SDS樣品。對(duì)融合蛋白進(jìn)行鑒定，使用考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)：pGEX-6P-1空載體標(biāo)簽表達(dá)蛋白約25kD大小。pGEX-6P-1-ATG13質(zhì)粒融合ATG13蛋白和GST標(biāo)簽蛋白大小約78kD左右，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量逐漸增加（如圖3所示）。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，分別使用一抗ATG13單抗和羊抗兔二抗進(jìn)行孵育，用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)發(fā)光后在相對(duì)分子質(zhì)量大約78kD位置有目標(biāo)條帶（圖4）。Western blot結(jié)果顯示，重組融合了GST標(biāo)簽的ATG13蛋白正常表達(dá)且大小為78kD左右。

圖3 ATG13的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖4 ATG13的Western blot分析

3 討論

細(xì)胞自噬（Autophagy）是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程[9-11]。

在大多數(shù)宿主中，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)或其他外因或內(nèi)因均可誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生。自噬途徑的激活依賴于ULK復(fù)合體，該復(fù)合體是細(xì)胞自噬網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)[12]。眾多的研究表明，ATG13蛋白是組成ULK復(fù)合體的重要亞基，本研究顯示ATG13蛋白的大小為53KD，在自噬過(guò)程中發(fā)揮重要的生理功能，是自噬研究的重要環(huán)節(jié)。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)ATG13蛋白除了啟動(dòng)自噬過(guò)程外，還參與了細(xì)胞其他重要的生理過(guò)程，如基因修復(fù)、蛋白逆轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡以及免疫應(yīng)答等，具體過(guò)程還需做更深層次的研究[13-14]。