申璐先，解廣東，榮寶海，王 猛，陳希琦，周永坤

統(tǒng)計(jì)研究顯示，2018年全球新發(fā)癌癥1810萬(wàn)例，其中結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）180.1萬(wàn)例，位于第3位，占所有腫瘤發(fā)病人數(shù)的10.2%[1]。結(jié)直腸癌是美國(guó)第三大常見(jiàn)癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因[2]。近年來(lái)，我國(guó)CRC發(fā)病率逐年上升，2015年CRC的發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤的第5位[3]。目前，腸鏡檢查、癌胚抗原檢查、影像學(xué)檢查及組織病理學(xué)檢查的分期評(píng)估是制定治療方案的重要依據(jù)[4]。遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移是影響CRC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是患者死亡的主要原因，盡管進(jìn)行了根治性手術(shù)和輔助治療，II～I(xiàn)II期CRC患者仍約有25%～50%的復(fù)發(fā)率[5]。

因此，臨床上需要一個(gè)具有前瞻性的生物標(biāo)志物，以便于更好地對(duì)CRC進(jìn)行早期診斷，監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、評(píng)估治療效果、預(yù)測(cè)長(zhǎng)期預(yù)后。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTCs）是目前廣泛研究的生物標(biāo)志物。CTCs檢測(cè)被稱(chēng)為“液體活檢”，與組織病理學(xué)檢查相比，液體活檢的侵入性更小，其基本檢測(cè)方法是在容易獲得的體液樣本中檢測(cè)特定的生物標(biāo)志物[6]，外周血是最常見(jiàn)的樣本，而尿液、唾液、胸腔積液和腹水等也可用于檢測(cè)。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、取材方便、易于重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)[7]。本文總結(jié)近年來(lái)CTCs的檢測(cè)技術(shù)，并探討其在CRC診治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 CTCs概述

CTCs是在實(shí)體腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)的一種罕見(jiàn)細(xì)胞亞群，它們穿過(guò)血管壁后進(jìn)入血液，腫瘤細(xì)胞通過(guò)遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，形成遠(yuǎn)處器官的繼發(fā)性腫瘤，這個(gè)假說(shuō)是由澳大利亞學(xué)者Ashwonh在1869年首次提出來(lái)[8]。CTCs僅存在于腫瘤患者體內(nèi)，其逃逸機(jī)制可能是通過(guò)上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)，在外周循環(huán)系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)的幫助下進(jìn)入血管中[9]。CTCs在腫瘤特異性抗原和基因?qū)W特征方面與原發(fā)腫瘤病灶高度相同，都具有極高的腫瘤特異性，可用于惡性腫瘤的體外“液體活檢”[10]。相對(duì)于傳統(tǒng)的影像學(xué)和腫瘤標(biāo)志物的檢查，檢測(cè)外周血中的CTCs具有靈活、快捷、無(wú)創(chuàng)等特點(diǎn)，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)療效和評(píng)估預(yù)后等都具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值。CTCs被美國(guó)FDA認(rèn)定為癌癥發(fā)展和監(jiān)測(cè)的新的生物標(biāo)志物[11]。

2 CTCs檢測(cè)

在過(guò)去幾十年中，研究人員致力于CTCs分析，CTCs的高敏感性和特異性的分離和表征在技術(shù)上已有明顯的突破[12]。但是對(duì)于如何定義CTCs所需的和充分的最低標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有共識(shí)；研究者們也不經(jīng)常把兩項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較[13]。CTCs的生物和物理特性已被國(guó)際公認(rèn)明顯不同于血液中的其他細(xì)胞[14]，這些細(xì)胞在血流中表現(xiàn)出極端的表型異質(zhì)性和罕見(jiàn)性。如CTCs在外周血的濃度極低，僅為幾百萬(wàn)分之一[15]，CTCs在血液中半衰期約為1～2.4 h[16]，在循環(huán)系統(tǒng)中只有極少數(shù)高活性、高轉(zhuǎn)移性的單個(gè)獨(dú)立存在腫瘤細(xì)胞才能存活下來(lái)[17]。CTCs的鑒定仍具有極高技術(shù)挑戰(zhàn)性。迄今為止，CTCs分離富集技術(shù)大致分為兩類(lèi)，一是利用CTCs的物理特性；二是利用CTCs表面標(biāo)記的免疫分選方法。

2.1 CellSearch系統(tǒng) CellSearch系統(tǒng)已被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于監(jiān)測(cè)乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌治療的反應(yīng)[18]。該系統(tǒng)是將磁性細(xì)胞分選技術(shù)、熒光抗體染色和半自動(dòng)熒光顯微鏡分析技術(shù)相結(jié)合，具有敏感度高、結(jié)果穩(wěn)定、檢測(cè)過(guò)程統(tǒng)一等特點(diǎn)。Cohen等[19]利用該系統(tǒng)檢測(cè)430例轉(zhuǎn)移性CRC患者外周血中CTCs數(shù)量，得出CTCs的數(shù)量是影響轉(zhuǎn)移性CRC患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立因素。

2.2 微流控設(shè)備檢測(cè) 微流控設(shè)備檢測(cè)是一種基于微流體收縮和電流傳感系統(tǒng)的機(jī)械低通濾波技術(shù)，其利用CTCs和血細(xì)胞的最佳收縮寬度不同，通過(guò)調(diào)整收縮寬度、信號(hào)強(qiáng)度和停留時(shí)間，從而切斷血液細(xì)胞的信號(hào)，增強(qiáng)CTCs收縮通道。該設(shè)備相對(duì)于傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)可避免存在假陰性，在細(xì)胞不經(jīng)任何表面的生化修飾的情況下從全血中直接檢測(cè)CTCs。Suzuki等[20]證實(shí)在沒(méi)有預(yù)處理或稀釋的全血中，設(shè)定6 μm寬收縮通道檢測(cè)CTCs，其在幾十毫秒的精度大于95%。

2.3 納米結(jié)構(gòu)界面 近年來(lái)隨著納米科技的進(jìn)步，在眾多CTCs檢測(cè)策略中，納米結(jié)構(gòu)界面已被廣泛應(yīng)用。納米粒子具有體積小、易與不同配體修飾、表面體積比高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)核酸適配體具有親和性好、成本低、易修飾、穩(wěn)定性好、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，這二者都促進(jìn)了納米結(jié)構(gòu)界面在檢測(cè)CTCs中的應(yīng)用[21]。Wang等[22]利用滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生的具有章魚(yú)臂形態(tài)的磁性DNA納米爪來(lái)捕獲癌細(xì)胞，因該爪結(jié)構(gòu)具有較好的剛性和柔韌性，且可攜帶多種抗體，故捕獲率高達(dá)95%，純度約達(dá)85%。

2.4 微流控芯片 微流控芯片技術(shù)成本低、通量高、樣品需求量小，可達(dá)到特異、靈敏、高捕獲率的效果，該技術(shù)是基于CTCs的生物學(xué)性質(zhì)差異和物理性質(zhì)差異來(lái)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的分選富集[23]。Toner實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了“CTCs-iChip”芯片，該芯片可依賴(lài)或不依賴(lài)腫瘤表面特異性表達(dá)在全血中快速的篩選CTCs，因而適用于所有癌癥[24]。Yang等[25]設(shè)計(jì)的“CTCs-△Chip”楔形芯片實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與常規(guī)血細(xì)胞大小差異及三色免疫細(xì)胞化學(xué)方法(CK+/CD45-/Nucleus+)鑒定標(biāo)記CTCs，并證實(shí)該系統(tǒng)在不同類(lèi)型的固體腫瘤2 ml外周血中，可檢測(cè)出2～15個(gè)CTCs，檢測(cè)靈敏度高，檢出率為75%。

3 CTCs在CRC的臨床價(jià)值

傳統(tǒng)上，需要通過(guò)組織活檢來(lái)確定腫瘤的組織學(xué)性質(zhì)及其遺傳概況，但因腫瘤的異質(zhì)性，組織活檢常常存在假陰性、創(chuàng)傷大、成本高等缺點(diǎn)[26]。相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方式，CTCs易于從外周血中獲得，可在沒(méi)有入侵的情況下對(duì)腫瘤進(jìn)行生物學(xué)監(jiān)測(cè)，也可對(duì)腫瘤的進(jìn)展進(jìn)行重復(fù)評(píng)估。研究表明，CTCs在評(píng)估非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性CRC的預(yù)后方面具有很高價(jià)值[27]。

3.1 CTCs對(duì)于早期CRC的診斷價(jià)值 在臨床中，結(jié)直腸早期癥狀是隱匿的，無(wú)明顯特異性。因此，大多數(shù)CRC發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，其治療效果及預(yù)后較差，故為了提高CRC患者5年生存率，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要。曹霞等[28]通過(guò)富集-免疫熒光原位雜交（SE-iFISH）技術(shù)檢測(cè)67例早中期CRC患者及同期20例健康志愿者外周血中CTCs，得出早中期CRC患者CTCs陽(yáng)性率為91.0%，明顯高于健康人的5.0%。郭華等[29]應(yīng)用CyttelTM-CTCs平臺(tái)檢測(cè)57例CRC患者及29例良性病變和健康受試者外周血標(biāo)本，結(jié)果顯示57例CRC患者中CTCs陽(yáng)性45例，而良性病變和健康受試者僅2例，前者比后者檢出率高(78.9% vs 6.9%)。Wen-Sy等[30]通過(guò)腸鏡檢查從620例CRC患者中篩選出438例診斷為腺瘤性息肉或早期至晚期CRC患者，然后進(jìn)一步進(jìn)行CTCs檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中111例(25%）為癌前病變，327例（75%）為CRC，CTCs檢出癌前病變的靈敏度為76.6%，特異度為97.3%；檢出CRC的靈敏度為86.9%，特異度為97.3%。CTCs檢出癌前病變和CRC的準(zhǔn)確率達(dá)到88.0%。因此，檢測(cè)CTCs有利于CRC的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

3.2 CTCs與CRC分期 晏玉武等[31]通過(guò)檢測(cè)71“例”結(jié)直腸患者的CTCs發(fā)現(xiàn)，根據(jù)臨床TNM分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況（N1、N2、N3）、腫瘤浸潤(rùn)深度（T1、T2、T3、T4)和腫瘤分化程度（高分化、中分化、低分化），CTCs陽(yáng)性率跟以上幾項(xiàng)均呈正相關(guān)。Tsai等[32]研究指出早期CRC患者腫瘤大小、位置、分化程度、轉(zhuǎn)移程度等方面均影響著CTCs的水平，且CTCs數(shù)量隨T分期增加而增加。還有研究發(fā)現(xiàn)CTCs陽(yáng)性與TNM分期有關(guān)，術(shù)后CTCs的數(shù)值與侵襲深度及腫瘤部位顯著相關(guān)，術(shù)前及術(shù)后CTCs水平與年齡、性別、腫瘤病灶的分化程度無(wú)關(guān)[28，33]。因此CTCs可作為CRC腫瘤分期的依據(jù)，可與組織活檢相結(jié)合，為CRC患者提供進(jìn)一步治療指導(dǎo)。

3.3 監(jiān)測(cè)CRC術(shù)前和術(shù)后CTCs的變化評(píng)估預(yù)后 在眾多影響外周血中CTCs數(shù)量的原因中，手術(shù)操作是一個(gè)極為重要的因素，術(shù)中腫瘤組織受到擠壓、牽拉等機(jī)械損傷，易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脫落入血，影響CTCs水平，增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。Wang等[34]研究130例Ⅱ～Ⅲ期CRC手術(shù)患者發(fā)現(xiàn)，術(shù)前CTCs計(jì)數(shù)明顯低于術(shù)后3 d的CTCs計(jì)數(shù)，且在評(píng)估非轉(zhuǎn)移性CRC手術(shù)患者的腫瘤復(fù)發(fā)存活率方面，術(shù)后CTCs優(yōu)于術(shù)前CTCs。Yang等[35]研究138例行根治術(shù)CRC患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs陽(yáng)性是預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)，與術(shù)前CTCs陽(yáng)性無(wú)關(guān)。另一研究表明，早中期CRC術(shù)后分良好預(yù)后組(術(shù)后CTCs＜3或術(shù)后CTCs數(shù)目比術(shù)前CTCs數(shù)目減少或持平)，反之則為不良預(yù)后組[28]。

3.4 CTCs用于指導(dǎo)治療 CRC患者化療的目的是清除殘留在循環(huán)中的游離腫瘤細(xì)胞及微轉(zhuǎn)移灶，傳統(tǒng)的生物學(xué)監(jiān)測(cè)與CTCs相結(jié)合將更有利于癌癥的精確治療，如用藥的安全性、療效、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面。王麗麗等[36]將121例晚期CRC患者化療后分為2組，腫瘤進(jìn)展組81例與腫瘤控制組40例，腫瘤進(jìn)展組CTCs陽(yáng)性率比控制組高（87.5%vs 58.0%，P=0.001），證明CTCs計(jì)數(shù)與晚期CRC的化療療效相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTCs或可作為化療效果早期評(píng)估的輔助性指標(biāo)。另一試驗(yàn)也證明了化療后CTCs陽(yáng)性率與療效呈負(fù)相關(guān)[33]。Sastre等[37]通過(guò)檢測(cè)CTCs計(jì)數(shù)及KRAS來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者接受貝伐珠單抗化療后的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)CTCs＜3/7.5 mL時(shí)，KRAS野生型腫瘤的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期均高于CTCs＞3/7.5 mL時(shí)，CTCs計(jì)數(shù)及KRAS是評(píng)估化療效果的獨(dú)立因素。Krebs等[38]研究得出CTCs分層計(jì)數(shù)可識(shí)別不同化療方案中獲益較多的患者，從而避免高毒性藥物在低CTCs組中使用。Font-Clos等[39]通過(guò)建立類(lèi)人型全身血液循環(huán)模型來(lái)模擬CTCs軌跡，該CTCs動(dòng)力模型可模擬腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散及黏附機(jī)制，同時(shí)結(jié)合影像學(xué)檢查甚至可能確定腫瘤未來(lái)的轉(zhuǎn)移部位，從而為腫瘤的轉(zhuǎn)移治療提供精確的指導(dǎo)。龐明輝等[40]檢測(cè)88例結(jié)腸癌患者術(shù)前1 d及術(shù)后1、6、12月末外周血中的CTCs數(shù)量，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度低、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者外周血中CTCs水平較高，術(shù)后12月末較1月末CTCs值升高的患者生存時(shí)間更短，腫瘤復(fù)發(fā)概率更高，因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTCs水平的變化有利于腫瘤復(fù)發(fā)的早期判斷、評(píng)估化療效果，對(duì)術(shù)后短期內(nèi)復(fù)發(fā)的Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期患者的治療方案的選擇有指導(dǎo)意義。

3.5 CTCs評(píng)估CRC患者長(zhǎng)期預(yù)后 外周血中CTCs的存在是大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因[41]。CTCs可以預(yù)測(cè)非轉(zhuǎn)移性CRC的未來(lái)轉(zhuǎn)移和不良的疾病結(jié)局，在轉(zhuǎn)移性CRC中則可以預(yù)示著轉(zhuǎn)移灶的重新播散[27]。曹霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)可依賴(lài)術(shù)后CTCs數(shù)值或動(dòng)態(tài)檢測(cè)手術(shù)前后CTCs的變化預(yù)測(cè)早中期CRC的預(yù)后。任鐵軍等[42]使用CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)CRC晚期患者外周血7.5 mL，基線CTCs＜3的人群中位無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期均高于CTCs≥3的人群(P＜0.05)，其認(rèn)為晚期CRC患者治療前檢測(cè)CTCs有一定的臨床價(jià)值。Tsai等[32]利用微流控裝置收集行CRC根治性手術(shù)患者的外周血7.5 mL，發(fā)現(xiàn)CTCs≥5個(gè)的患者一年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率是CTCs＜5個(gè)患者的8倍。另一項(xiàng)使用CellSearch系統(tǒng)的前瞻性研究也證明了每7.5 mL血液中CTCs＞1個(gè)的CRC患者預(yù)后較差[43]。汪棟等[44]應(yīng)用密度梯度離心法和免疫熒光法檢測(cè)69例Ⅱ～Ⅲ期CRC患者術(shù)前、術(shù)后3 d及術(shù)后14 d外周血中的CTCs，發(fā)現(xiàn)CRC患者術(shù)后3 d和術(shù)后14 d的CTCs陽(yáng)性率與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，因此檢測(cè)CRC患者圍手術(shù)期外周血中CTCs數(shù)目有助于預(yù)后判斷及腫瘤復(fù)發(fā)并提早干預(yù)。

綜上所述，CTCs與癌細(xì)胞在基因表達(dá)方面具有高度的相似性，可以從不同方面反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，如腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、進(jìn)化及突變等，對(duì)癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、診斷、鑒別具有重要意義。近年來(lái)，CTCs的檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用到胃腸道腫瘤的多個(gè)方面，評(píng)估預(yù)后、監(jiān)控微小病灶及腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)反應(yīng)/耐藥、輔助確定精準(zhǔn)治療方案等。CTCs與傳統(tǒng)的腫瘤活檢有很好的一致性，檢測(cè)外周血中CTCs使獲取腫瘤標(biāo)本更容易，并能對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)以跟蹤病情[45]。但是現(xiàn)實(shí)中CTCs的檢測(cè)還存在著諸多不足，尚無(wú)如何定義CTCs最低標(biāo)準(zhǔn)的共識(shí)，檢測(cè)程序標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，檢驗(yàn)結(jié)果存在假陰性和假陽(yáng)性，缺乏普遍化、靈活快捷、低成本的檢驗(yàn)裝置等。盡管如此，隨著CTCs富集分析技術(shù)的進(jìn)步，CTCs的重要性在胃腸癌患者的治療和診斷中將會(huì)進(jìn)一步得以體現(xiàn)。