楊 梅，陳偉賢，張曉蘭，薛 姣，高海燕

常州市第二人民醫(yī)院乳腺外科，江蘇 常州 213000

乳腺癌是危害女性健康和生命安全的常見惡性病癥，有著較高發(fā)病率，近年來，隨著人們飲食結構和生活方式變化，臨床乳腺癌的發(fā)病率表現(xiàn)出上升趨勢，對女性身心健康和生活質(zhì)量造成極大影響。早發(fā)現(xiàn)、早診斷是乳腺癌臨床針對性治療的關鍵［1］?，F(xiàn)階段，臨床乳腺癌的診斷方法較多，以乳腺超聲和乳腺鉬靶最為常用，可通過超聲聲像與血流顯像特征進行早期診斷，進而行早期治療?，F(xiàn)階段，乳腺鉬靶是針對乳腺疾病的最理想、最簡便、最可靠的無創(chuàng)檢測手法，無明顯痛苦，操作簡便，同時有著圖像分辨率高、重復性良好等優(yōu)勢［2］。

近幾年來，國內(nèi)外對乳腺癌鉬靶X線征象與腫瘤分子生物學指標相關性進行了一定研究，也得到一些結論。比如證實乳腺鉬靶密度和乳腺癌發(fā)生風險呈正相關［3］。乳腺癌病灶主要表現(xiàn)為高密度，可能與癌變病灶存在出血、鐵血黃素沉積、病灶鈣化及纖維組織等因素有關，病灶密度越高，表明腫瘤細胞增殖活躍、惡性度越高，預后越差。細胞癌變及成惡性腫瘤是在多因素、多基因影響和作用下形成的，經(jīng)諸多復雜步驟漸進式或突變結果，而在此過程中不可忽略的因素就是激素參與的機體調(diào)控失衡［4］。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可能影響乳腺癌生物學特性。有研究對原發(fā)性乳腺癌患者術前乳腺鉬靶攝片和腫瘤分子生物學指標表達的對應狀態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)乳腺鉬靶攝片密度和乳腺癌某些細胞學特征有關。同時，對乳腺癌鉬靶X線形態(tài)學分析，發(fā)現(xiàn)E-Cad及VEGF的陽性率和腫瘤組織影像學征象具有相關性，由此表明鉬靶攝片征象和腫瘤分子生物學間的關系在臨床上可能有更深層次的價值［5］。而Twist蛋白屬于編碼位于常染色體7p21.2，由202個蛋白質(zhì)構成，對于胚胎成長效果及細胞遷移功能具有極為顯著的影響，是堿性螺旋環(huán)-螺旋蛋白家族內(nèi)一類極為保守的轉錄調(diào)控因子。有資料顯示，Twist在阻抑腫瘤細胞程序性死亡，促進腫瘤細胞侵襲作用，轉錄期間具有關鍵的影響。

近年來，伴隨免疫組織化學檢測技術的創(chuàng)新發(fā)展，乳腺惡性鈣化鉬靶攝片征象和免疫組織化學檢測技術的生物學標志物間的相關性日益受到臨床重視，對乳腺癌惡性鈣化早期診斷、預后判斷有重要價值。本課題對243例經(jīng)手術證實的原發(fā)性乳腺癌患者的臨床情況進行研究，現(xiàn)將本課題研究報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集并整理常州市第二人民醫(yī)院2015年3月—2019年4月診治的243例手術治療的乳腺癌患者臨床資料。本組患者均為女性，經(jīng)病理學、影像學等檢查確診。在術前行鉬靶X線片檢查，均接受手術治療。本組患者在術前均未行放化療。本組患者年齡38～67歲，平均（52.1±2.7）歲；病程1～5年，平均（2.7±0.8）歲；病灶直徑1.85～9.40 cm，平均（4.73±0.88）cm；已婚148例，未婚95例；浸潤性導管癌220例，浸潤癌9例，髓樣癌8例，其他6例。術后行免疫組織化學檢測，依照檢測結論，將其分為4組，分別為A組［VEGF(-)、E-Cad(-)］、B組［VEGF(+)、E-Cad(+)］，C組［VEGF(+)、E-Cad(-)］、D組［VEGF(-)、E-Cad(+)］，分別為82例、41例、83例和37例。

1.2 方法

1.2.1 乳腺鉬靶X線檢查

選用美國GE公司生產(chǎn)的數(shù)字化乳腺鉬靶X線機進行檢查，采取常規(guī)雙乳軸位攝片，及內(nèi)外側斜攝片，如發(fā)現(xiàn)乳腺內(nèi)存在疑似性病灶或鈣化需局部放大來檢查。通過自動化模式，獲得圖像后會傳至工作站處理。

1.2.2 免疫組織化學檢測

1.2.2.1 實驗試劑

VEGF、E-Cad鼠抗人單克隆抗體，鼠/兔免疫組織化學檢測SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；PBS（pH為7.4）購自上海信裕生物科技有限公司；檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L，pH為6.0）購自北京藍博斯特生物技術有限公司；EDTA緩沖液（0.05 mol/L，pH為8.0）購自湖南艾佳生物科技股份有限公司。

1.2.2.2 儀器

所用儀器包括Leica RM2235型切片機、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、電磁爐、常規(guī)水浴盒、Olympus BX51型光學顯微鏡以及配套攝片系統(tǒng)。

1.2.2.3 免疫組織化學檢測方法

將腫瘤組織取出后進行石蠟包埋切片處理，常規(guī)脫蠟至水，用PBS進行沖洗，持續(xù)3 min，進行3次；再將切片浸于EDTA緩沖液中再對組織抗原行高壓熱修復5 min，再迅速冷卻后應用蒸餾水漂洗；滴入適量H2O2去離子水，溫育10 min，以此阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；置入PBS沖洗，持續(xù)3 min，3次；每份切片滴入血清，在室溫下溫育10 min；將血清傾倒出來，不清洗，每份切片滴加一抗抗體，再入濕盒內(nèi)，在室溫下進行溫育，持續(xù)60 min；用PBS沖洗3 min，連續(xù)3次；滴加生物素標記二抗工作液，于室溫下溫育10 min；用PBS沖洗3 min，連續(xù)3次；滴加鏈霉親和素-過氧化物溶液，于室溫下溫育10 min；用PBS沖洗3 min，連續(xù)3次；滴加DAB顯色劑3～5 min，再充分水洗；蘇木精復染，鹽酸分化處理，乙醇脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片；置于光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 判斷標準

采用Twist蛋白作為判定依據(jù)。VEGF陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)內(nèi)能見到淡黃-棕黃色顆粒，很少量在細胞膜內(nèi)，基于細胞染色度與陽性細胞百分比得分和予以判定，隨機選取5個高倍鏡視野予以判斷［2］：①無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。② 陽性細胞≤5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。如兩項得分和在3～6分則判斷為陽性（+），＜3分為陰性（-）。對于E-Cad陽性細胞胞膜內(nèi)能見到淡黃-棕黃色顆粒，很少量存在于細胞質(zhì)，在切片內(nèi)陽性染色細胞在≥90%判定為陽性（+），如切片內(nèi)陽性率＜90%，或僅是細胞質(zhì)或無染色細胞判定為陰性（-）。每張切片均由2個臨床經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行盲審判定結果。鈣化點狀分布為較大區(qū)間內(nèi)聯(lián)系分布的鈣化，一般在超過2 cm2，多形性鈣化為不同形態(tài)的鈣化，呈分枝狀、點狀、桿狀。

1.4 統(tǒng)計學處理

通過SPSS 20.0軟件對本課題研究進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)指標以n（%）表示，組間相比通過χ2與Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 本組免疫組織化學檢測及分組

通過免疫組織化學檢測（圖1～2），將VEGF、E-Cad表達一致患者分成4組：A組，82例，即VEGF（-）、E-Cad（-）；B組，41例，即VEGF（+）、E-Cad（+）；C組83例，即VEGF（+）、E-Cad（-）。D組，37例，VEGF（-）、E-Cad（+）。

圖1 E-Cad免疫組織化學檢測結果Fig.1 E-Cad immunohistochemistry results

圖2 VEGF免疫組織化學檢測結果Fig.2 VEGF immunohistochemistry results

2.2 本組惡性鈣化發(fā)生情況

從本組出現(xiàn)的惡性鈣化病例看，符合條件患者及A組患者病例和惡性鈣化間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而B、C、D組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。惡性鈣化鉬靶攝片見圖3、4。

表1 各組惡性鈣化的發(fā)生情況Tab.1 The occurrence of malignant calcification in each group ［n (%)］

圖3 右乳下象限惡性鈣化（箭頭處）Fig.3 Right lower quadrant malignant calcification (arrow)

圖4 為右乳上象限腫塊伴鈣化（箭頭處）Fig.4 The right upper breast quadrant with calcification (arrow)

2.3 各組Twist蛋白和乳腺癌惡性鈣化形態(tài)征象

從惡性鈣化形態(tài)表現(xiàn)看，符合條件患者及A組患者的病例間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組Twist蛋白和乳腺癌惡性鈣化形態(tài)征象Tab.2 Twist protein and malignant calcification signs of breast cancer ［n (%)］

2.4 本組惡性鈣化數(shù)量情況

從惡性鈣化數(shù)量看，符合條件患者及A組患者病例相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 各組惡性鈣化數(shù)量對比Tab.3 Comparison of the number of malignant calcifications in each group ［n (%)］

2.5 原發(fā)性乳腺癌組織內(nèi)Twist和VEGF以及E-cad表達相關性

研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織內(nèi)Twist蛋白陽性表現(xiàn)與VEGF陽性表達呈正相關（P＜0.05），Twist蛋白陽性表現(xiàn)與E-cad陽性表達呈負相關（P＜0.05，表4）。

表4 原發(fā)性乳腺癌組織內(nèi)Twist和VEGF以及E-cad表達的關聯(lián)Tab.4 Association of Twist and VEGF and E-cad expression in primary breast cancer tissues

3 討 論

鈣化是乳腺病變中常見的一種異常影像學征象，認為是細胞內(nèi)氫氧磷灰石鈣鹽沉積物。雖從化學成分不能區(qū)分鈣化的良惡性，但大量研究表明，相比乳腺良性腫瘤，惡性腫瘤的鈣化發(fā)生概率顯著增高。當前，對于鈣化的形成機制尚未完全明確，但主要有這兩種觀點：①細胞變性壞死鈣化說，就是腫瘤灶局部血供不足，致腫瘤細胞變性、壞死，大量磷酸根被分解，Ca2+濃度升高，二者共同作用導致磷酸鈣物質(zhì)沉積；② 細胞活躍分泌鈣化說，就是腫瘤細胞增殖活躍，組織代謝異常而分泌鈣質(zhì)，在達飽和時就會引起鈣質(zhì)沉著。從這兩個觀點看，不管是壞死的，還是存活的腫瘤細胞均會鈣化。同時鈣化是乳腺癌診斷中重要征象和確診證據(jù)，特別是在觸診無典型異常的“隱性”乳腺惡性腫瘤的診斷中，有著不可替代的作用，臨床上很大部分的乳腺癌可通過單純鈣化檢查進行診斷。研究表明，乳腺癌鉬靶X線攝影片中鈣化的顯示超過40%，而在病理切片中，這一發(fā)現(xiàn)率上升到70%以上。從臨床情況，典型惡性鈣化灶在形態(tài)上一般表現(xiàn)為小叉狀、泥沙狀，但大部分的形態(tài)是不規(guī)則的，顆粒量多、分布廣。相比良性鈣化，惡性鈣化灶邊緣粗糙、體積小，特征相對顯著，鉬靶X線攝片和其他影像學方法比較，能更為敏感地顯示出鈣化征象，所以，臨床將鉬靶X線攝片作為早期乳腺癌診斷方法。研究表明，40%以上乳腺癌影像學檢查可見鈣化征象。乳腺癌鈣化原因可能是與腫瘤細胞變形、組織壞死之后出現(xiàn)鈣鹽沉積、腫瘤細胞分泌鈣等有關。早期檢出乳腺癌惡性鈣化對治療具有重要指導意義。

VEGF是血小板源性生長因子家族一個主要成員，屬于特異性強的同源二聚體糖蛋白［6］。其作用主要是促進血管內(nèi)皮細胞增殖，以及改善和提升血管通透性。VEGF被認為是一種特異性內(nèi)皮生長因子，能增加血管滲透性，促進新血管生成，有著多樣化的生物學特性，這和VEGF配、受體間的相互作用復雜性是一致的。VEGF是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的最強的對血管產(chǎn)生直接性作用和影響的內(nèi)皮生長因子，在腫瘤發(fā)展中，其會導致血管生成加快，增加大量異常腫瘤血管，加快腫瘤發(fā)展。有研究報道，VEGF高表達在出現(xiàn)惡性鈣化乳腺癌患者中的陽性率要低于無惡性鈣化患者［7］。

E-Cad屬于Ca2+依賴性細胞黏附素，是一種機體細胞間重要的黏附因子；如果其表達降低會致腫瘤細胞間的連接性降低，進而造成腫瘤細胞自原發(fā)病灶脫落進到基底膜。有研究報道［8］，子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)的E-Cad表達低于正常組織。并伴隨肌層浸潤度增大、FIGO分期增加，其陽性率會隨之下降，由此表明E-Cad表達可直接導致腫瘤細胞趨向離散，易從原發(fā)灶脫落，侵犯到鄰近組織和血管，進而出現(xiàn)轉移；同時，E-Cad表達和細胞分化度有著密切關系，相比低分化病例，高分化病例的E-Cad表達更高。研究表明，E-Cad表達水平和乳腺惡性鈣化數(shù)量密切相關［9］。

從臨床情況看，乳腺病變病理切片中鈣化檢出率達到70%以上。彭竹琴等［10］研究報道，早期乳腺癌鈣化的乳腺鉬靶X線檢查率在30%～50%。惡性鈣化是早期乳腺癌鉬靶X線檢查中一個重要征象，大多數(shù)表現(xiàn)為大小不均、染色濃淡不均，且大多表現(xiàn)為細小顆粒狀，通常是密集成簇分布［11］。臨床普遍認為直徑＜0.5 mm的獨立叢狀微小鈣化如果在10枚/mm2，那么惡性鈣化的風險比較大［12-13］。惡性鈣化是早期診斷隱性乳腺癌一種重要依據(jù)。本次研究針對選取的243例患者按照免疫組織化學檢測條件進行分組，對各組患者鈣化形態(tài)、鈣化數(shù)量等方面進行檢測，結果顯示，在A組患者出現(xiàn)惡性鈣化數(shù)量為12例，占比為14.46%，B組惡性鈣化數(shù)量為18例，占比為43.90%，C組為35例，占比為42.17%，D組為17例，占比為45.94%，由上述數(shù)據(jù)可知，A組惡性鈣化占比明顯低于B組、C組及D組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對4組Twist蛋白以及乳腺惡性鈣化形態(tài)征象研究發(fā)現(xiàn)，A組患者點狀陽性率為50%，B組為44.44%，C組為34.28%，D組為29.41，A組點狀陽性率明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），A組多形態(tài)陰性率為12.1%，B組為14.6%，C組為10.8%，D組為13.5%，4組患者多形態(tài)陰性率相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對4組患者惡性鈣化數(shù)量對比，A組鈣化數(shù)量低于15枚患者數(shù)為66.67%，B組為27.78%，C組為31.43%，D組為23.53%，鈣化數(shù)量為15～35枚間A組占比為33.33%，B組為55.55%，C組為%，D組為13.5%。

同時，A組患者中VEGF、E-Cad免疫組織化學檢測均呈陰性表達，與乳腺癌惡性鈣化發(fā)生率、形態(tài)表現(xiàn)及鈣化灶數(shù)量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在B、C、D組中VEGF、E-Cad免疫組織化學檢測均為陽性表達的乳腺癌的惡性鈣化上述三個方面差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；通過對Twist蛋白、VEGF以及E-Cad表達的與乳腺癌陽性表達率的關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，Twist蛋白、VEGF陽性表達率明顯高于癌旁組織，并且Twist蛋白、VEGF陽性表達情況與惡性鈣化出現(xiàn)情況存在緊密關聯(lián)，與患者年齡、惡性鈣化形態(tài)及惡性鈣化數(shù)量無關；E-Cad陽性表達率顯著低于癌旁組織，且E-Cad陽性表達情況和惡性鈣化出現(xiàn)情況存在緊密關聯(lián)，與患者年齡、惡性鈣化形態(tài)及惡性鈣化數(shù)量不存在關聯(lián)性。乳腺癌組織內(nèi)Twist蛋白陽性表達與VEGF陽性表達呈正相關（P＜0.05），Twist蛋白陽性表達與E-Cad陽性表達呈負相關（P＜0.05）。由此表明，乳腺癌是否出現(xiàn)惡性鈣化和VEGF、E-Cad陽性表達間存在正相關性［14-15］。且Twist蛋白或許經(jīng)VEGF介導的腫瘤血管過度形成，進而對腫瘤的進展與遷移等方面存在重要影響，此外Twist蛋白或許經(jīng)自身調(diào)節(jié)控制特質(zhì)導致E-cad表達下降，進而造成腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉化。既往研究在鈣化形態(tài)上的結果有所不同，在發(fā)生機制上還需進一步研究。這可能和鈣化形態(tài)的分類標準及方法有關，及在樣本研究中細化至鈣化形態(tài)研究的樣本量比較少有關。鈣化數(shù)量和既有研究結果基本一致，但是關于鈣化數(shù)量和乳腺癌標志物表達間關系的研究還不多。

綜上所述，鈣化在乳腺癌診斷中有著重要價值。在乳腺癌鉬靶X線攝片中，有無惡性鈣化、鈣化形態(tài)及數(shù)量等征象與VEGF、E-Cad不同表達存在相關性。這為乳腺癌分子生物學表現(xiàn)及預后判斷提供重要的依據(jù)，為臨床綜合治療提供有價值的指導。