金晶晶，殷于磊，顧 晏，蘇敏君，肖 立

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院病理科，上海 200040

胸水是腫瘤和非腫瘤疾病的常見(jiàn)臨床表現(xiàn)，其性質(zhì)的判斷對(duì)臨床診斷治療有重要意義。傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法是胸水離心后的沉淀物涂片，近年來(lái)液基細(xì)胞學(xué)（liquid-based cell test，LCT）技術(shù)的應(yīng)用，提高了細(xì)胞學(xué)制片質(zhì)量，更易于光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步，單純的細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷已無(wú)法滿(mǎn)足臨床診斷治療的需求［1-2］，免疫組織化學(xué)和分子檢測(cè)已經(jīng)成為必要的輔助手段，離心后細(xì)胞學(xué)包塊是常用方法之一，但相對(duì)耗時(shí)、腫瘤細(xì)胞較少時(shí)容易丟失。本研究運(yùn)用LCT制片技術(shù)，直接行胸水細(xì)胞學(xué)免疫組織化學(xué)檢測(cè)和觀察，鑒別反應(yīng)性間皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞，并確定腫瘤細(xì)胞組織來(lái)源，探討其臨床應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

回顧性分析復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院病理科2016—2017年間在胸水中找到脫落細(xì)胞的病例，收集其中96例標(biāo)本，診斷為找到癌細(xì)胞、存在異型上皮細(xì)胞巢、可能為反應(yīng)性間皮細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 H-E染色片及白片的制備

使用美國(guó)BD公司的PrepStain全自動(dòng)液基細(xì)胞制片機(jī)。前期標(biāo)本處理方式：①收到的胸水標(biāo)本振蕩均勻祛除凝塊、微粒及黏液，再將樣本轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，放入離心機(jī)并以600×g的轉(zhuǎn)速離心10 min，倒掉上清液，保留下層的細(xì)胞沉積物。若胸水標(biāo)本量多可以重復(fù)離心后并管。② 在離心管中加入15 mL CytoRich紅色固定液，振蕩后放置至少30 min，放入離心機(jī)，以600×g的轉(zhuǎn)速離心10 min，倒掉上清液并振蕩。③如果未見(jiàn)或僅見(jiàn)少量的細(xì)胞沉淀，加入10 mL蒸餾水振蕩后全部轉(zhuǎn)移到12 mL離心管內(nèi)；如果見(jiàn)較大或很大的細(xì)胞沉淀，將部分標(biāo)本（吸取1～5滴）轉(zhuǎn)移到12 mL離心管內(nèi)，并加入10 mL蒸餾水。將離心管放入離心機(jī)，以600×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，倒掉上清液并振蕩。④ 將貼上標(biāo)簽的12 mL離心管放到PrepStain全自動(dòng)液基細(xì)胞制片機(jī)上進(jìn)行自動(dòng)制片。⑤ 根據(jù)制片程序制成多張白片及H-E染色片一張。將制備完成的白片放入95%的乙醇中使其保持濕潤(rùn)狀態(tài)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將全自動(dòng)液基細(xì)胞制片機(jī)上制備的白片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)所用抗體甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1）、P63、WT1、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、CK7、CK20、CDX2、CA19-9、P53、PAX2、TG為購(gòu)自丹麥DAKO公司及福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的即用型抗體，采用丹麥DAKO公司的Autostainer Link48全自動(dòng)免疫組織化學(xué)機(jī)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用EnVision兩步法。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料和薄層細(xì)胞學(xué)H-E染色

96例患者，男性57例，女性39例，平均年齡72.9歲（46～95歲）。39例無(wú)明顯陽(yáng)性病史而以胸水為首發(fā)癥狀，10例有肺癌病史或影像學(xué)顯示肺內(nèi)占位性病灶，3例有乳腺癌切除病史，4例有結(jié)腸腺癌切除病史，2例有胰腺導(dǎo)管腺癌病史，1例有胃腺癌病史，1例甲狀腺濾泡癌復(fù)發(fā)二次手術(shù)病史，1例有卵巢漿液性癌病史，1例有前列腺癌病史，其余病例有心衰、慢性腎功能衰竭等良性病變病史。經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查明確找到癌細(xì)胞的有39例，其中傾向腺癌細(xì)胞31例，傾向鱗狀細(xì)胞癌2例，低分化癌需分型6例；腫瘤性細(xì)胞與反應(yīng)性間皮細(xì)胞需鑒別17例；傾向反應(yīng)性間皮40例。

2.2 薄層細(xì)胞學(xué)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

LCT白片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，最終診斷癌46例，反應(yīng)性間皮43例，仍不確定是反應(yīng)性間皮或腫瘤細(xì)胞的有7例（表1）。在46例診斷癌細(xì)胞病例中，TTF-1陽(yáng)性而明確肺腺癌的有19例（圖1），占惡性病例的59.3%，其中1例同時(shí)有結(jié)腸癌病史，TTF1（+）/CDX2（-）。P63/P40陽(yáng)性的鱗狀細(xì)胞癌3例（圖2）。CDX2染色陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌2例（圖3）。CA19-9陽(yáng)性的胰腺癌2例（圖4）。TTF1/TG染色陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性甲狀腺濾泡癌1例（圖5）。ER/PR/HER2陽(yáng)性染色的轉(zhuǎn)移性乳腺癌3例，其中1例患乳腺癌4年（原發(fā)），ER/PR/HER2均為（3+），胸水細(xì)胞學(xué)為ER（2+）/PR（-）/HER2（3+）；另外2例乳腺癌病史分別為5、11年，原發(fā)腫瘤免疫標(biāo)志不詳，胸水細(xì)胞學(xué)為ER（3+）/PR（-）/HER2（3+）及ER（+）/PR（+）/HER2（-）（圖6）。WT1（+）/P53（+）/ER（+或-）/PAX2（+）染色的轉(zhuǎn)移性卵巢漿液性癌2例（圖7），其中1例以胸水為首發(fā)癥狀，經(jīng)胸水診斷后發(fā)現(xiàn)盆腔腫塊。14例腺癌或低分化癌細(xì)胞無(wú)法判斷來(lái)源，原因是病史不明確、異型細(xì)胞量少且在免疫組織化學(xué)片內(nèi)消失或腫瘤細(xì)胞脫片、所選的器官特異性抗原均不表達(dá)。7例經(jīng)免疫組織化學(xué)染色無(wú)法區(qū)分反應(yīng)性間皮細(xì)胞和癌細(xì)胞，原因是間皮和其他特異性上皮標(biāo)志均不表達(dá)、細(xì)胞量有限且無(wú)法再次提取細(xì)胞，建議臨床結(jié)合病史和影像學(xué)檢查再次送檢細(xì)胞學(xué)或取組織活檢。43例明確反應(yīng)性間皮細(xì)胞TTF1（-）/P63（-）/WT1（+）（圖8）。6例肺腺癌診斷后剩余胸水送檢EGFR基因突變檢測(cè)，其中3例存在基因突變陽(yáng)性，且均為L(zhǎng)858R突變。

表1 細(xì)胞學(xué)免疫組織化學(xué)并結(jié)合臨床病史的診斷結(jié)果Tab.1 Diagnosis resulted from cytological immunohistochemistry and clinical history n(%)

圖1 肺腺癌細(xì)胞學(xué)診斷Fig.1 Lung adenocarcinoma detected by cytological diagnosis

圖2 鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞學(xué)診斷Fig.2 Squamous cell carcinoma detected by cytological diagnosis

圖3 結(jié)腸腺癌細(xì)胞學(xué)診斷Fig.3 Colon adenocarcinoma detected by cytological diagnosis

圖4 胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞學(xué)診斷Fig.4 Pancreatic ductal adenocarcinoma detected by cytological diagnosis

圖5 甲狀腺濾泡癌（二次手術(shù)復(fù)發(fā)后）的細(xì)胞學(xué)診斷Fig.5 Thyroid follicular carcinoma (recurrence after the second surgery) detected by cytological diagnosis

圖6 乳腺癌病史、原發(fā)腫瘤免疫標(biāo)志不詳?shù)男厮?xì)胞學(xué)檢查Fig.6 Cytology of pleural exfoliation with a history of breast cancer,without immunostaining result in primary tumor

圖7 漿液性癌的細(xì)胞學(xué)診斷Fig.7 Serous carcinoma detected by cytological diagnosis

圖8 反應(yīng)性間皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)WT1陽(yáng)性Fig.8 WT1 positive expression in reactive mesothelial cells detected by immunohistochemistry (EnVision,×200)

3 討 論

體液脫落細(xì)胞學(xué)是臨床病理學(xué)檢查常用的方法之一，近年來(lái)自動(dòng)化的LCT制片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，確保了提取足夠量的細(xì)胞、背景干凈、細(xì)胞分布均勻、結(jié)構(gòu)清晰，提高了制片質(zhì)量，尤其是在脫落的腫瘤細(xì)胞少、背景中有較多炎癥細(xì)胞或黏液時(shí)，LCT的前處理可充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，提高腫瘤細(xì)胞的檢出率和診斷分型的準(zhǔn)確率［3-4］。

體液脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本包括胸水、腹水、心包等，其中胸水標(biāo)本更常見(jiàn)，惡性胸水中多數(shù)是肺癌，部分是其他組織器官來(lái)源的癌，肺癌以TTF1陽(yáng)性腺癌常見(jiàn)，本文研究中占59.3%，有限的免疫組織化學(xué)抗體可以解決大多數(shù)診斷問(wèn)題。而腹水、心包積液臨床狀況復(fù)雜、惡性細(xì)胞往往缺乏器官特異性標(biāo)志，常需要更多免疫組織化學(xué)抗體標(biāo)志。LCT雖然省時(shí)、便捷，但制片數(shù)量有限、制片成本較高，更合適運(yùn)用于相對(duì)簡(jiǎn)單的胸水免疫組織化學(xué)，而腹水、心包積液用包塊檢查相對(duì)經(jīng)濟(jì)，可以提供更多檢查方法。

LCT制片利用自然沉降，固定液中可保存30 d，細(xì)胞形態(tài)保持良好，在標(biāo)本量足夠時(shí)，還可制備至少6～8張質(zhì)量相同的細(xì)胞學(xué)白片，可以利用白片進(jìn)一步做特殊染色或免疫組織化學(xué)檢查，補(bǔ)充形態(tài)學(xué)觀察的局限性。此外，我們還利用了多余細(xì)胞進(jìn)行EGFR分子檢測(cè)，得到了良好的DNA質(zhì)量和檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需細(xì)胞包塊過(guò)程，為患者提供了快速精準(zhǔn)的診斷治療依據(jù)。

相比于細(xì)胞學(xué)包塊檢查，直接的細(xì)胞學(xué)白片快捷、便利，避免了細(xì)胞學(xué)包塊因離心不足、黏液較多或腫瘤細(xì)胞少時(shí)收集到的細(xì)胞量的不足，同時(shí)也能獲得良好染色效果，但缺點(diǎn)是固定時(shí)間有限，不能永久保存，因此需要一次性全面足夠檢測(cè)所有診斷治療相關(guān)項(xiàng)目，并無(wú)法用于回顧性科研、進(jìn)一步其他類(lèi)型的檢測(cè)［5］。

盡管LCT制片質(zhì)量較好，但有時(shí)增生或退變的間皮細(xì)胞不易與腺癌細(xì)胞鑒別，易造成假陰性或假陽(yáng)性診斷［6］，同時(shí)，胸水診斷惡性時(shí)，如果明確惡性腫瘤的組織器官來(lái)源，可以幫助臨床醫(yī)師制定進(jìn)一步的治療方案。我們嘗試直接細(xì)胞學(xué)白片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，幫助判斷反應(yīng)性間皮、腫瘤細(xì)胞及腫瘤來(lái)源。我們的研究表明，大多數(shù)病例經(jīng)免疫組織化學(xué)染色可以明確診斷，并結(jié)合臨床病史判定腫瘤來(lái)源。仍有少量病例雖經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，因剩余細(xì)胞量少、染色結(jié)果不佳或不表達(dá)任何器官特異性標(biāo)志物等原因無(wú)法明確是否是腫瘤以及腫瘤的類(lèi)型和來(lái)源，此類(lèi)病例通常需要再次送檢胸水標(biāo)本或組織活檢。

胸水中最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移性腫瘤是肺腺癌，細(xì)胞核TTF1染色可以明確診斷，但除了肺腺癌，甲狀腺癌也表達(dá)TTF1，因此臨床病史（甲狀腺乳頭狀癌或?yàn)V泡癌病史）、影像學(xué)檢查非常重要，結(jié)合甲狀腺球蛋白TG染色可以提供幫助。部分患者同時(shí)有多種腫瘤發(fā)生，胸水中鑒別是否是肺腺癌或其他腫瘤轉(zhuǎn)移對(duì)臨床治療非常重要，TTF1染色提供了可靠的證據(jù)［7］。

P63是鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)志物，鱗狀細(xì)胞癌常伴壞死、炎癥反應(yīng)，而脫落細(xì)胞的數(shù)量較少，散在的細(xì)胞核陽(yáng)性比普通染色片更易發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，免疫組織化學(xué)是良好的輔助手段，當(dāng)然，P63僅是鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)志物，無(wú)法區(qū)分肺原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤，必須結(jié)合病史。

胸水中的乳腺癌轉(zhuǎn)移除了提示臨床有轉(zhuǎn)移外，還需提供ER、PR、HER2狀態(tài)為進(jìn)一步治療提供幫助。我們直接將液基細(xì)胞學(xué)制片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查，結(jié)果良好，其中HER2的細(xì)胞膜強(qiáng)染色易于判斷，可為臨床靶向治療提供依據(jù)。結(jié)直腸腺癌轉(zhuǎn)移可用CDX2細(xì)胞核染色標(biāo)志證實(shí)，胰腺癌可用CK7、CA19-9標(biāo)志證實(shí)，而胃腺癌目前沒(méi)有很好的器官特異性標(biāo)志物。

WT1是我們常用的鑒別反應(yīng)性間皮細(xì)胞核染色標(biāo)志，同時(shí)也是卵巢漿液性癌的標(biāo)志，因此，常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查是基礎(chǔ)，漿液性癌細(xì)胞學(xué)異型性大，結(jié)合P53、PAX2或8、ER等標(biāo)志可以區(qū)分，當(dāng)然參考臨床病史和影像學(xué)檢查結(jié)果可以明確診斷。另外，WT1也是惡性間皮瘤標(biāo)志，間皮瘤有時(shí)在細(xì)胞學(xué)上很難與反應(yīng)性間皮相區(qū)別，間皮瘤罕見(jiàn)，Desmin標(biāo)志陽(yáng)性有助于區(qū)分反應(yīng)性間皮細(xì)胞［8］。

綜上所述，LCT直接免疫組織化學(xué)染色方法在胸水脫落細(xì)胞學(xué)診斷中可行，雖然存在一定的局限性，但它仍是輔助診斷肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、明確部分轉(zhuǎn)移性癌組織器官來(lái)源的可靠方法。