栗春梅，俞曉飛

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是臨床常見的急性腦血管疾病，占腦卒中總發(fā)病率的10%～15%，是最嚴重的腦卒中亞型，致殘率、致死率非常高[1-3]。腦出血后腦損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性損傷是由于血腫占位和顱內(nèi)壓增高導(dǎo)致；繼發(fā)性損傷是由于血腫釋放其分解產(chǎn)物，如凝血酶和亞鐵離子等，可刺激腦組織釋放炎性因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)使得血腦屏障通透性增加，出現(xiàn)腦組織水腫、血腫周圍神經(jīng)細胞凋亡等一系列損傷[4]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)作為一種重要的炎性因子，近期由于其在炎癥損傷和組織修復(fù)中的雙重作用，引起了廣泛的關(guān)注[5-6]。研究提示腦出血急性期HMGB1作為早期促炎細胞因子可促進腦出血后的炎癥反應(yīng)[7]，通過與糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)[8]、Toll樣受體(TLR)中的TLR2、TLR4[9]等相結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)信號并介導(dǎo)細胞反應(yīng)，促進破壞性炎性因子的釋放而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。腦出血恢復(fù)期，HMGB1亦可以通過促進神經(jīng)細胞增殖、遷移及血管內(nèi)皮生長因子表達，從而介導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生、血管再生等有益神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[10]。

1 HMGB1概述

HMGB1是一種具有內(nèi)源性細胞因子活性的核蛋白，廣泛表達于包括神經(jīng)細胞在內(nèi)的大多數(shù)真核細胞中。生理條件下，HMGB1定位于細胞核，其功能為穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)，促進基因轉(zhuǎn)錄。病理條件下，HMGB1從細胞核釋放到細胞外空間時起促炎細胞因子的作用[11]。HMGB1作為損傷相關(guān)的分子模式(DAMP)可通過與細胞膜表面多種受體結(jié)合，包括RAGE、TLR2和TLR4等，引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進免疫細胞釋放細胞因子[如白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)]及其他致炎細胞因子，進而激活并觸發(fā)下游炎癥反應(yīng)。

研究表明HMGB1的細胞外生物學(xué)功能可能取決于HMGB1蛋白 C23、C45和C106位點上半胱氨酸殘基的氧化還原修飾狀態(tài)[12]。根據(jù)氧化還原狀態(tài)的不同，HMGB1有3種形式，即還原型HMGB1、二硫化型HMGB1、氧化型HMGB1。炎癥損傷使活性氧(ROS)、活性氮(RNS)等氧化信號在細胞內(nèi)積聚，誘導(dǎo)HMGB1發(fā)生不同程度的氧化反應(yīng)，使其從細胞核轉(zhuǎn)位至細胞漿，或釋放到細胞外。生理條件下細胞核HMGB1是C23、C45、C106位點均連接硫醇側(cè)鏈的還原型HMGB1(SH-SH-SH)。當還原型HMGB1直接被釋放到細胞外環(huán)境中時，ROS/RNS將其部分氧化，形成二硫化型HMGB1(S-S-SH)。當細胞處于高度氧化環(huán)境或有大量ROS/RNS釋放時，細胞氧化損傷嚴重，HMGB1呈氧化型HMGB1(R-SO3H)。還原型HMGB1可作為一種趨化因子，可以與CXC趨化因子配體12(CXCL12)形成一個趨化因子復(fù)合物，并通過激活CXC趨化因子受體4(CXCR4)，或與RAGE受體相互結(jié)合從而募集炎性細胞并誘導(dǎo)其向損傷組織、炎癥區(qū)域定向遷移[13-14]。二硫化型HMGB1通過結(jié)合TLR4/MD-2復(fù)合物誘導(dǎo)炎癥細胞產(chǎn)生一系列細胞因子促進炎癥反應(yīng)[15]。Venereau等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉損傷模型中，還原型HMGB1在肌肉損傷后2 h在細胞外環(huán)境中普遍存在，而二硫化型HMGB1在6 h后出現(xiàn)，表明還原型HMGB1首先釋放到細胞外從而募集炎癥細胞向損傷組織區(qū)域遷移，然后免疫細胞(如單核巨噬細胞等)直接分泌二硫化型HMGB1，或者通過ROS/RNS部分氧化細胞外還原型HMGB1間接產(chǎn)生二硫化型HMGB1。最終，持續(xù)的ROS/RNS誘導(dǎo)生成氧化型HMGB1，在炎癥消退過程中HMGB1被氧化而滅活。氧化型HMGB1介導(dǎo)細胞的免疫耐受，既無趨化因子活性也無細胞因子刺激活性。然而，近期有研究發(fā)現(xiàn)氧化型HMGB1能夠促進損傷組織修復(fù)。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)在乙酰胺基酚誘導(dǎo)肝損傷小鼠模型中，采用質(zhì)譜分析儀分析，炎癥早期血清HMGB1以二硫化型HMGB1活性形式存在，誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子；炎癥消退和肝再生過程中以氧化型HMGB1非活性形式存在。結(jié)論提示了半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)HMGB1的細胞因子活性。

2 HMGB1與腦出血

2.1 HMGB1在腦出血急性期的炎性損傷作用 HMGB1正常情況下主要存在于神經(jīng)元細胞核內(nèi)，腦出血損傷后由壞死神經(jīng)元釋放，或由巨噬細胞等免疫細胞主動釋放。HMGB1釋放到細胞外，作用于相應(yīng)受體，促進炎性因子的流入介導(dǎo)神經(jīng)血管單元炎癥，出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞活化、增加血腦屏障通透性、腦水腫、神經(jīng)元凋亡等一系列炎性損傷。

研究顯示腦出血小鼠血腫周圍組織中HMGB1水平明顯升高，72 h達到高峰，5 d下降[18]。HMGB1在腦出血后1 h內(nèi)被釋放到胞漿內(nèi)，釋放的HMGB1有助于小膠質(zhì)細胞的活化，引起炎癥反應(yīng)，誘發(fā)腦水腫、神經(jīng)細胞凋亡導(dǎo)致腦損傷[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)腦出血病人血清HMGB1水平明顯升高，并且與IL-6、TNF-α等炎性因子水平，第10天美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分及3個月改良Rankin量表(MRS)評分明顯相關(guān)[18]。HMGB1的釋放增強腦出血后炎性因子表達，這些炎性因子的上調(diào)可能有助于星形膠質(zhì)細胞增殖和血腫周圍區(qū)域的中性粒細胞募集，并導(dǎo)致血腦屏障損傷和腦水腫。抗HMGB1抗體抑制HMGB1釋放至血腫周圍細胞間隙，降低血清HMGB1水平，減少活化的小膠質(zhì)細胞和炎性相關(guān)因子的表達，保護血腦屏障的完整性，減少腦水腫[19]。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予丙酮酸乙酯(EP，HMGB1抑制劑)后腦出血大鼠血腫周圍HMGB1和活化小膠質(zhì)細胞表達明顯降低，神經(jīng)元凋亡、腦水腫和神經(jīng)功能缺損情況明顯改善[7]。

腦出血急性期，釋放至細胞外的HMGB1作為促炎因子，主要通過識別表達在小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞上的TLR或者RAGE受體，激活小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞放大炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1通過與其受體TLR4結(jié)合之后可以靶向上調(diào)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達，從而降解基底層，破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)，血腦屏障通透性增加，誘發(fā)腦水腫，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重[20]。HMGB1-TLR4-NF-κB在腦出血后繼發(fā)性損傷中有重要作用，利用丙酮酸乙酯處理后，HMGB1表達下調(diào)，下游炎癥介質(zhì)(IL-1β、TNF-α)表達亦下調(diào)，并改善腦出血引起的腦水腫和神經(jīng)功能損害[21]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1-RAGE信號在腦出血急性期可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，用丙酮酸乙酯或FPS-ZM1(RAGE受體抑制劑)處理后，大鼠腦出血血腫周圍炎性細胞浸潤及白細胞介素1(IL-1)、MMP-9表達明顯降低，腦水腫、出血量和腦損傷明顯減少[22]。

2.2 HMGB1在腦出血修復(fù)期的促修復(fù)作用 近年來，研究者發(fā)現(xiàn)HMGB1其在腦出血后期的潛在有益作用，HMGB1能夠促進神經(jīng)再生和血管生成以支持神經(jīng)功能的恢復(fù)[10]。Lei等[10]發(fā)現(xiàn)HMGB1在腦出血后期促進神經(jīng)發(fā)生和血管生成，造模后第7天～第14天給予丙酮酸乙酯每日1次，發(fā)現(xiàn)HMGB1表達下調(diào)，同時第10天和第14天同側(cè)紋狀體中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和神經(jīng)生長因子(NGF)水平降低，5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和血腫周圍的雙皮質(zhì)素(DCX)雙標陽性細胞數(shù)減少，提示新生神經(jīng)元細胞數(shù)減少。張會敏等[23]體外實驗研究發(fā)現(xiàn)外源性重組HMGB1可促進胚胎神經(jīng)干細胞(NSCs)的增殖和分化。

Lei等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)腦出血后14 d HMGB1、RAGE、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、VEGF、MMP-9相關(guān)因子表達以及BrdU和DCX陽性細胞數(shù)量均明顯高于基線水平給予丙酮酸乙酯后可明顯抑制腦出血誘導(dǎo)蛋白表達的增加。FPS-ZM1給藥后BDNF、VEGF和MMP-9的表達以及BrdU和DCX陽性細胞數(shù)減少，提示腦出血后HMGB1-RAGE信號通路可能促進腦出血后神經(jīng)發(fā)生及血管再生。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1通過激活MAPK通路增強NSCs增殖，而內(nèi)源性敲除HMGB1表達，MTS/BrdU檢測顯示敲除HMGB1明顯抑制NSCs增殖，同時發(fā)現(xiàn)NSCs中的HMGB1表達下調(diào)抑制了ERK、JNK、p38的磷酸化，消除了MAPK信號通路對細胞增殖的作用。Hayakawaa等[27]體外實驗研究發(fā)現(xiàn)活化星形膠質(zhì)細胞可以在卒中恢復(fù)過程中釋放HMGB1促進內(nèi)皮祖細胞(EPCs)增殖介導(dǎo)的神經(jīng)血管重塑。siRNA抑制星形膠質(zhì)細胞中的HMGB1或阻斷EPCs中的RAGE受體可以防止這種反應(yīng)。提示刺激星形膠質(zhì)細胞可釋放HMGB1與EPCs上的RAGE受體結(jié)合，促進EPCs增殖，介導(dǎo)神經(jīng)血管重塑。Li等[28]研究發(fā)現(xiàn)活化星形膠質(zhì)細胞釋放的HMGB1在體外促進神經(jīng)干細胞/祖細胞(NS/PCs)增殖，在NS/PCs中阻斷RAGE或抑制JNK信號通路可抑制HMGB1誘導(dǎo)的NS/PCs增殖。表明活化星形膠質(zhì)細胞釋放的HMGB1通過結(jié)合RAGE并且增強JNK信號通路的磷酸化促進NS/PCs增殖。提示RAGE-JNK信號通路的激活在活化星形膠質(zhì)細胞釋放的HMGB1促進NS/PCs增殖中有重要作用。Xue等[29]體外實驗研究表明HMGB1通過絲狀偽足形成促進NSCs遷移，F(xiàn)PS-ZM1和RAGE特異性的siRNA可以消除增強NSCs的遷移效應(yīng)。提示HMGB1-RAGE軸通過促進絲狀偽足形成促進NSCs的遷移，促進腦出血受損區(qū)域的修復(fù)。

HMGB1在腦卒中后的雙重生物學(xué)作用可能取決于其半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)。腦卒中后細胞外HMGB1的氧化還原狀態(tài)可能決定其損傷及修復(fù)作用。研究發(fā)現(xiàn)在蛛網(wǎng)膜下隙出血模型注射二硫化型HMGB1和氧化型HMGB1，蛛網(wǎng)膜下隙出血 14 d后，與溶劑組相比，二硫化型HMGB1組NGF、BDNF、VEGF的表達及DCX和BrdU陽性細胞數(shù)均降低，尼氏染色顯示神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，而氧化型HMGB1組結(jié)果與之相反。同時發(fā)現(xiàn)二硫化型HMGB1組血清和腦脊液中TNF-α水平及腦含水量明顯高于溶劑組，氧化型HMGB1組與溶劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。二硫化型HMGB1組神經(jīng)功能缺損評分明顯高于溶劑組，而氧化型HMGB1組神經(jīng)功能缺損明顯改善。蛛網(wǎng)膜下隙出血加入二硫化型HMGB1，可增加蛛網(wǎng)膜下隙炎性因子水平。結(jié)果提示二硫化型HMGB1可以作為炎癥的啟動子，并參與蛛網(wǎng)膜下隙出血后大鼠炎性細胞因子的表達，氧化型HMGB1沒有顯示出促炎作用，反而增加了生長因子水平，促進神經(jīng)元存活[30]。因此，研究腦出血后HMGB1不同氧化還原狀態(tài)，將有助于了解其在腦出血不同時期的生物學(xué)作用，通過干預(yù)HMGB1的氧化還原狀態(tài)，進而抑制HMGB1的炎性損傷，促進神經(jīng)血管再生，或許可能成為腦出血藥物研究的新靶點。

3 結(jié)語與展望

HMGB1在腦出血后發(fā)揮復(fù)雜的雙向作用，在腦出血急性期有促炎作用，在恢復(fù)期發(fā)揮有益作用。HMGB1-RAGE信號通路介導(dǎo)了腦出血急性期的炎癥反應(yīng)，并且在腦出血恢復(fù)期可以促進神經(jīng)發(fā)生和血管重塑，突出了HMGB1和RAGE在腦出血組織反應(yīng)中的復(fù)雜作用。此外，HMGB1氧化還原狀態(tài)可能與體內(nèi)微環(huán)境有關(guān)，不同的氧化修飾決定其功能狀態(tài)，氧化型HMGB1可能促進組織損傷修復(fù)。近年來，中醫(yī)藥多靶點治療腦卒中作用日益受到重視。中藥復(fù)方對于疾病的治療作用往往不是單向的，因其復(fù)方中不同藥物成分發(fā)揮協(xié)同作用，常?？梢云鸬诫p向調(diào)節(jié)的功效。研究發(fā)現(xiàn)生地大黃湯對腦出血大鼠有確切的神經(jīng)保護作用，通過抑制腦出血大鼠急性期HMGB1/TLR4/MMP-9信號通路表達，改善腦組織炎性損傷，減輕腦水腫，減少神經(jīng)細胞凋亡數(shù)，降低神經(jīng)功能缺損評分，有效促進腦出血損傷恢復(fù)[31-32]。因此，進一步深入研究中藥通過抑制二硫化型HMGB1促進氧化型HMGB1形成，從而抑制炎癥反應(yīng)促進神經(jīng)血管重塑，具有重要的臨床價值和科學(xué)意義。