劉慧茹，葉碧珍，魏轉(zhuǎn)弟

作者單位：東莞市中醫(yī)院皮膚科，廣東 東莞523000

長島型掌跖角化癥（Nagashima-type palmoplantar Keratosis，NPPK）是一種常染色體隱性遺傳病，男女發(fā)病率相似，臨床表現(xiàn)的特征為掌跖角化癥，該病于1977年首次在長島被報告［1］。其臨床特征包括手掌和腳掌上界限清楚的紅斑并輕中度角化過度；長島型掌跖角化癥通常在嬰幼兒期開始發(fā)病，表現(xiàn)為輕微的掌跖斑疹病，皮疹進展慢［2］。

GJB2屬于β-族間隙連接蛋白家族，按蛋白分子量命名為Cx26。間隙連接蛋白與縫連接蛋白組成一個完整的縫隙連接通道，在細胞間信息傳導和物質(zhì)交換起重要作用。表皮的基底層含有增殖的角質(zhì)形成細胞，分化產(chǎn)生的細胞可遷移到棘突和顆粒層［3］。角質(zhì)形成細胞具有許多細胞間連接，包括間隙連接［4］。β-族間隙連接蛋白突變可能誘導皮膚病發(fā)生，其中Cx26的GJB2突變會導致皮膚病綜合征，包括耳聾的掌跖角化?。≒PK），Vohwinkel綜合征（VS）和角膜炎魚鱗病耳聾綜合征（KID）［5-7］。Cx31（GJB3）和Cx30.3（GJB4）突變引起的皮膚病癥狀相似，主要表現(xiàn)為變異性紅皮膚角化癥（EKV）［8］。目前大量研究集中在間隙連接蛋白導致KID綜合征的作用機制，但對于與NPPK相關(guān)的突變鮮有研究。

本研究于2017年收集了家系的2例NPPK病人，對病人的外周血提取DNA，進行SERPINB7基因外顯子8常見突變位點c.796C＞T（p.Arg266Ter）進行測序，未發(fā)現(xiàn)突變。因此，我們推測該家系病人可能是由于其他相關(guān)基因（GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1）突變引起。本研究擬通過鑒定NPPK的突變位點，闡明NPPK的發(fā)病機制，為NPPK的治療提供一定的理論依據(jù)。

表1 長島型掌跖角化癥（NPPK）中GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1基因PCR擴增引物序列

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為收集的2例家系NPPK病人，分別于3歲和4歲開始發(fā)病，臨床表現(xiàn)為雙手掌、指背、足底、手腕、踝部、跟腱等對稱性紅斑、角化性斑丘疹、斑塊伴脫屑。組織病理學表現(xiàn)為表皮角化過度、顆粒層和棘層增厚，無表皮松解性角化過度的特點，真皮淺層少量毛細血管擴張，少量炎癥細胞浸潤。該例病人的臨床及組織病理符合長島型掌跖角化癥。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取與sanger測序 收集NPPK病人外周血3～5 mL，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取血液DNA，利用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，保存-70℃?zhèn)溆?。從美國國家生物技術(shù)信息中心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 獲 得 GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1這5個基因的序列，設(shè)計引物（表1）。以下條件進行PCR擴增：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，在72℃延伸2 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min終止反應。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將獲得的5個基因的PCR產(chǎn)物送華大基因進行正反向引物測序。用Gene tool軟件將測定的序列與標準序列進行比對，標 準 序 列 參 考 ：GJB2：NM_004004，GJB6：NM_001110219， GJB3： NM_001005752， GJB1： NM_000166，GJB4：NM_153212。

1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄及卵母細胞顯微注射 將Cx26和Cx31克隆到pCS2+表達載體中，用于非洲爪蟾卵母細胞的功能研究［9］。通過定點誘變制備Cx26-S183F結(jié)構(gòu)體［10］，并將DNA結(jié)構(gòu)體克隆到pBlueScri1ptⅡ載體中并測序，然后亞克隆到pCS2+表達載體中。將定點誘變的結(jié)構(gòu)體使用SP6 mMessage mMachine體外轉(zhuǎn)錄試劑盒線性化并轉(zhuǎn)錄。從非洲爪蟾雌性中收集卵母細胞，并在改良的Barth（MB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)［11］，向卵母細胞注射10 ng反義非洲爪蟾Cx38寡核苷酸［12］，然后單獨或組合注射連接蛋白轉(zhuǎn)錄物，注入水的卵母細胞作為陰性對照。Cx31 RNA和其他cRNA都以相同的濃度注射。

1.2.3 記錄半通道電流 卵母細胞注射各種cRNA 24h后使用Gene Clamp 500放大器檢測其半通道電流。將卵母細胞培養(yǎng)在不添加Ca2+的MB培養(yǎng)基中，在室溫條件下進行膜片鉗實驗。將電極拉至1～2 MΩ的電阻，電極內(nèi)灌注電極內(nèi)液。通過記錄半通道電流：鉗制電壓為-40 mV，電壓從-30 mV去極化至+40 mV，階躍10 mV每次持續(xù)5 s，從而獲得半通道電流-電壓（I-V）曲線。并在初始鉗制電壓-40 mV情況下，測量兩個細胞的電流變化來計算連接電導（Gj）。一個細胞受±20 mV的交變脈沖，在另一個細胞中記錄由電壓變化產(chǎn)生的電流，其大小與連接電流（Ij）相等，通過Ij除以電壓差計算電導率，即Gj＝Ij/（V1-V2）。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 卵母細胞如1.2.2做相同的處理，24 h后提取蛋白。在12%的SDS凝膠上電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉37℃封閉 1 h，用 CX26（GBJ2）或 Cx31（GBJ3）（ABCAM，Cambridge）的多克隆抗體進行檢測，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h。用GADPH（ABCAM，Cambridge）作為內(nèi)參。使用Image J軟件對條帶灰度值進行量化分析。

1.2.5 免疫共沉淀 卵母細胞如1.2.2做相同的處理，24 h后利用膜蛋白提取試劑盒提供的說明書提取膜蛋白。用PBS清洗兩遍珠子，用PBS將Protein A agarose配制成50%濃度，蛋白樣品中加入Protein A瓊脂糖珠去除非特異性蛋白。用Cx26抗體孵育，加入Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，樣品煮沸5 min變性。在SDS凝膠上進行電泳，轉(zhuǎn)膜后使用Cx26或Cx31的抗體進行WB檢測蛋白質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 11.0軟件對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，進行單因素方差分析One-Way ANOVA，并用Student’s t檢驗進行差異比較分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 sanger測序篩選出GJB2突變引起NPPK GJB2基因核苷酸序列第584位堿基由C突變成T（c.548C＞T）發(fā)生了突變，導致編碼的蛋白第183位的絲氨酸被苯丙氨酸取代（p.Ser183Phe）。NPPK病人的父母均為GJB2p.Ser183Phe雜合子突變攜帶者，100個與該家族不相關(guān)的正常漢族人中沒有檢測到p.Ser183Phe突變位點。

2.2 Cx26突變體無功能且抑制野生型連接蛋白Cx31 已有研究證實Cx31突變體可引起嚴重的皮膚病，當其與野生型Cx31共表達時，通道電導率降低，影響間隙連接通道的能力［13］。因此我們猜測Cx26突變體可能通過與Cx31互相作用從而出現(xiàn)NPPK。為證實這一點，Cx26-S183F及其他表皮連接蛋白在非洲爪蟾卵母細胞中表達及Cx31在非洲爪蟾卵母細胞中表達，檢測間隙連接電導Gj。用水注射的卵母細胞陰性對照組的電導幾乎可忽略（Gj＝0.18 μS），而只注射Cx26的細胞的平均Gj為8.6μS。在單獨注射Cx26-S183F的卵母細胞中測量的電導與陰性對照組細胞相同（Gj＝0.13μS），說明功能喪失。當共同注射Cx26-S183F和Cx26時，平均電導為2.9 μS，顯著低于單獨注射Cx26的（P＜0.05，圖1A）。Cx26-S183F還顯示出對Cx31的反式顯性抑制，當兩者都存在于卵母細胞中時，Cx26-S183F顯著抑制Cx31（Gj＝0.77 μS，P＜0.05，圖1B）。結(jié)果表明Cx26-S183F能有效抑制野生型Cx31，Cx26突變體與Cx31互作可能會產(chǎn)生NPPK。

圖1 檢測各處理組（注入水、Cx26、Cx26-S183F、Cx26-S183F+Cx26）卵母細胞的間隙連接的電導率：A為檢測野生型Cx26、Cx26突變體及Cx26-S183F+Cx26的電導率，B為檢測野生型Cx31、Cx31+Cx26及Cx31+Cx26-S183F的電導率

2.3 突變蛋白表達缺失不會引起電導率的降低用蛋白質(zhì)印跡法檢測野生型和突變體連接蛋白的表達。結(jié)果顯示，注射Cx31、Cx31+Cx26、Cx31+Cx26-S183F的處理組中均檢測到Cx31蛋白（31kDa）（圖2A），灰度值分析表明各處理之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2B）。同理，在Cx26、Cx31+Cx26、Cx26-S183F、Cx26+Cx26-S183F及Cx31+Cx26-S183F處理組中均檢測到Cx26（26kDa）（圖2C），且表達量一致，定量分析顯示各處理組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2D）。說明Cx26-S183F突變體存在時功能活性的喪失與Cx31的翻譯效率無關(guān)。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測長島型掌跖角化癥（NPPK）突變體及野生型Cx31的表達水平：A為WB檢測各處理組中Cx31的表達情況；B為WB檢測各處理組中Cx26的表達情況；C為量化分析Cx31的蛋白表達量；D為量化分析Cx26的蛋白表達量

2.4 Cx26突變體與Cx31的互相作用 為了證實Cx26突變體和Cx31可能形成異型通道，我們對共表達Cx31和Cx26突變體的細胞進行免疫共沉淀實驗。結(jié)果表明，在Cx26相關(guān)樣品中檢測到Cx26蛋白，而在含有Cx31的樣品中均檢測到Cx31蛋白（圖3A和圖3B），說明細胞裂解液可進行后續(xù)CO-IP實驗。CO-IP顯示Cx26蛋白在野生型和突變體樣品中有表達，Cx26+Cx31樣品在31KDa出現(xiàn)較弱的條帶，說明野生型Cx26與Cx31結(jié)合較弱。共表達Cx31和Cx26-S183F樣品中蛋白的表達量較高，表明Cx26突變體蛋白與Cx31發(fā)生免疫共沉淀（圖3C）。

2.5 Cx26突變體不能形成功能性半通道 KID綜合征突變體單獨存在時通常形成活躍的半通道［14-16］，而NPPK突變是否會出現(xiàn)類似的情況，為證實這一結(jié)果，在單個卵母細胞中表達Cx26和Cx26-S183F來分析半通道活性。結(jié)果顯示，注射水的卵母細胞對照在所有電壓階段被限流（圖4A），Cx26半通道活性在去極化時出現(xiàn)外向電流（圖4B），與注射Cx26的細胞相比，Cx26-S183F的膜電流顯著地降低（圖4C）。以平均膜電流和膜電壓作圖，表達CX26的細胞出現(xiàn)較高的外向電流，并隨著去極化的增加而增加，在+60mV時，Cx26產(chǎn)生的電流顯著高于對照及Cx26-S183F突變體（P＜0.05，圖4D）。結(jié)果說明，注射突變體的細胞天然半通道活性喪失，Cx26-S183F與野生型Cx26的共表達導致半通道活性降低。

圖3 免疫共沉淀（CO-IP）檢測長島型掌跖角化癥（NPPK）中Cx26突變體與Cx31的互作情況：A和B分別為WB檢測細胞裂解液中Cx31、Cx26的表達情況；C為CO-IP檢測Cx26突變體與Cx的互相作用

圖4 膜片鉗實驗檢測長島型掌跖角化癥（NPPK）野生型Cx26和突變體的膜電流：A為檢測注射水的對照組卵母細胞的電流，B為檢測單獨注射Cx26的卵母細胞的電流，C為檢測單獨注射Cx26突變體的卵母細胞的電流，D為半通道I-V曲線圖

2.6 Cx26突變體能增強Cx31半通道 CO-IP實驗證明Cx31與異型半通道中的Cx26突變體結(jié)合，從而導致Cx26 NPPK突變體改變了Cx31的活性。因此驗證了Cx26-S183F是否也會影響Cx31半通道活性。結(jié)果顯示，單獨注射Cx31的卵母細胞沒有半通道活性（圖5A），由Cx31和Cx26-S183F組成的異型半通道出現(xiàn)較高的電流（圖5B）。以電流和電壓作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在電壓的增加下，共表達Cx26-S183F和Cx31的細胞中的半通道活性顯著增加，說明具有半通道功能。Cx31和Cx26-S183F共表達細胞產(chǎn)生的電流在-30、-20、-10、0、10、20、30、40、50、60 mV分別達到 0.135、0.21、0.235、0.3、0.315、0.38、0.40、0.41、0.44、0.46 μA，顯著高于單獨表達Cx31的細胞產(chǎn)生的電流（P＝0.0316，圖5C）。這些結(jié)果說明，當共表達形成異型連接子時，Cx31和Cx26突變體能夠形成功能性半通道。

圖5 膜片鉗實驗檢測長島型掌跖角化癥（NPPK）Cx31和Cx26-S183F共表達時的膜電流：A為檢測單獨注射Cx31的卵母細胞的電流，B為檢測注射Cx26-S183F+Cx31的卵母細胞的電流，C為半通道I-V曲線圖

3 討論

NPPK由絲氨酸蛋白酶抑制劑B7（SERPINB7）基因突變引起。在本實驗中，測序發(fā)現(xiàn)2例病人的NPPK并不是由SERPINB7突變引起，通過測序發(fā)現(xiàn)一個與NPPK發(fā)生相關(guān)的GJB2突變。

當單獨表達時，Cx26-S183F不能形成功能性同源半通道或間隙連接，但與Cx31共表達后，降低了Cx31間隙連接的活性，并增加了半通道活性。Cx31和Cx26突變體的免疫共沉淀顯示形成異型連接子，Cx26突變體具有修飾Cx31半通道和縫隙連接的能力。

目前，大量研究表明間隙連接半通道在病理條件下能開放，為細胞間的物質(zhì)交換提供通路。間隙連接半通道過量或長時間的開放會導致離子調(diào)節(jié)的失常，細胞內(nèi)ATP濃度的變化和代謝產(chǎn)物丟失，最終導致細胞死亡［17］。不同間隙連接蛋白基因的突變可以導致同一種遺傳學疾病，已有研究發(fā)現(xiàn)，Cx26突變與Cx43互作會引起掌跖角化?。?8］。本項研究發(fā)現(xiàn)了Cx26-S183F與Cx31共表達會增強間隙連接半通道活性，從而引起NPPK。

Cx31在表皮上表達，而且Cx31突變會引起遺傳性皮膚病，被稱為變異性紅皮膚角化病（EKV），其特征為軀干和四肢的皮膚過度角化，并伴有紅斑出現(xiàn)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，與Cx26突變相關(guān)的引起的皮膚病有KID綜合征、PPK、先天性耳聾伴發(fā)角質(zhì)厚皮病等［20-23］。目前為止關(guān)于Cx26突變引起皮膚病的機制有兩種：（1）抑制其他角質(zhì)形成細胞連接蛋白；（2）異常的半通道的形成。反式顯性負效應作用會減少連接蛋白類型的數(shù)量從而影響表皮細胞間通訊，導致通道功能異常，而活躍的半通道會產(chǎn)生代謝物向細胞外釋放，可能對鄰近細胞產(chǎn)生不利影響，從而引發(fā)細胞凋亡［24］。

在Cx26和Cx31突變引起皮膚病的病人中，觀察兩者之間的臨床特征存在相似性。四肢出現(xiàn)過度角化病變，這表明可能與NPPK出現(xiàn)的機制相似。除此之外，還有Cx26突變引起的Bart-Pumphrey綜合征KHLS也有相似的臨床癥狀，包括角化過度和白細胞減少癥［25］。盡管癥狀相似，但仍需要進一步研究突變體確認其相關(guān)機制，Cx31-G8V突變的表達導致半通道的形成，允許鈣離子流入細胞，從而造成KHLS［26］。有研究發(fā)現(xiàn)Cx30.3突變體會引起變異性紅皮膚角化病（EKV），當Cx31和Cx30.3-F137L共同轉(zhuǎn)染時，在細胞膜上檢測到與Cx31形成間隙連接，并能形成異聚體連接子［27］。最近的一項研究表明，造成KID形成的Cx26-S17F突變體存在的情況下，Cx31半通道活性增加［28］。這與我們的研究結(jié)果一致，Cx26-S183F不能單獨形成半通道或間隙連接，但在與Cx31共表達時可以增強半通道活性，從而引起NPPK。

這些研究結(jié)果表明Cx26在皮膚疾病中的重要性，并進一步突出了Cx26突變體和Cx31互相作用在遺傳性皮膚病中的作用機制，為進一步治療皮膚病提供一定的理論基礎(chǔ)。