梁志偉， 謝秀儀， 羅國(guó)楨， 吳苑芳， 鄭怡， 鄧專(zhuān)紅， 梁佩珍

開(kāi)平市中心醫(yī)院血液科(廣東江門(mén) 529300)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以9號(hào)染色體和22號(hào)染色體易位并產(chǎn)生BCR-ABL融合基因?yàn)橹饕卣鱗1]。世界衛(wèi)生組織調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)慢性髓系白血病的發(fā)病率為(3.5～5.5)/10萬(wàn)，且呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。以伊馬替尼為代表的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)可靶向抑制BCR-ABL蛋白激酶的活性，促進(jìn)克隆性白血病細(xì)胞凋亡，顯著提高CML患者的緩解率和生存率[3]。隨著TKIs藥物的使用，部分患者出現(xiàn)耐藥，大量的研究證據(jù)提示BCR-ABL依賴(lài)途徑和BCR-ABL非依賴(lài)途徑是導(dǎo)致耐藥的主要原因[4-5]。BCR-ABL異常擴(kuò)增和ABL激酶區(qū)點(diǎn)突變是BCR-ABL依賴(lài)途徑耐藥的主要原因，激酶區(qū)發(fā)生T315I突變時(shí)對(duì)第1代和第2代的TKI藥物均不敏感[6]。泊那替尼作為第3代TKI藥物，可有效治療出現(xiàn)T315I突變的慢性髓系白血病患者[7]，Breccia等[8]研究認(rèn)為泊那替尼可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境，促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步清除CML細(xì)胞。Linder等[9]研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可通過(guò)Notch通路，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的凋亡。泊那替尼對(duì)Notch通路的影響及對(duì)T315I突變細(xì)胞株增殖和凋亡的影響的相關(guān)報(bào)道較少。2017年9月至2019年5月期間，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究泊那替尼對(duì)T315I突變細(xì)胞株Notch信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步揭示CML患者耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 T315I突變CML細(xì)胞株KBM5R(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液病研究所惠贈(zèng))、DMSO(美國(guó)sigma公司)、泊那替尼原料藥(上海翰香生物制品有限公司)、重組人核轉(zhuǎn)錄因子-κB(rhNF-κB)(美國(guó)Promega公司)、DMEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)sigma公司)、Hoechst33258試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)、RIPA裂解液(武漢博士德生物科技有限公司)、抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司、酶標(biāo)儀(德國(guó)Bio-Tek公司)、共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)、電泳儀(美國(guó) Corning 公司)、移液器(德國(guó) Eppendorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 KBM5R細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)立對(duì)照組(C組)，泊那替尼組(P組)：加入泊那替尼處理細(xì)胞，泊那替尼+rhNF-κB組(Pr組)：加入泊那替尼和rhNF-κB共同處理細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBM5R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104，接種于96孔板中，設(shè)立對(duì)照組，加入不同濃度的泊那替尼進(jìn)行處理，濃度分別為：0.5、1、2、5、10、20和50 μmol/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去孔板內(nèi)液體，每孔加入100 μL含5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清，加入150 μL的DMSO，震蕩混勻，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在570 nm處的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的增殖情況，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，確定適宜的泊那替尼濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBM5R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104，接種于96孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB[10]，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，處理細(xì)胞48 h，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡數(shù)量 采用Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡數(shù)量：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBM5R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105，接種于6孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，加入適量的新鮮配置的4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min，用PBS清洗3次，每孔加入50 μL的Hoechest33258染色劑，室溫條件下避光孵育10 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)，記錄各組細(xì)胞的凋亡情況：若細(xì)胞的胞核出現(xiàn)高亮的藍(lán)色則表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，記為凋亡細(xì)胞。

1.2.4 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞的活性氧(ROS)水平 采用DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞的ROS水平：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBM5R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105，接種于6孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育20 min，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，調(diào)節(jié)共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBM5R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105，接種于6孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入適量的RIPA裂解液，加入1%的蛋白酶抑制劑和1%的磷酸酶抑制劑，提取各組細(xì)胞的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞蛋白的濃度，制備等濃度的上樣緩沖液后，用15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、新鮮配置的5%脫脂奶粉封閉蛋白條帶1 h。按目的條帶大小切下條帶，4℃孵育兔(Rabbit)-胱天蛋白酶3(Caspase3)、Rabbit-B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Rabbit-Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Rabbit-Notch1、Rabbit-發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)因子1(Hes1)、Rabbit-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和Rabbit-GAPDH過(guò)夜，TBST清洗3次，室溫下用辣根過(guò)氧化物酶共軛的二抗孵育1 h，TBST清洗3次。配置ECL顯影液，于暗室內(nèi)曝光、顯影，計(jì)算各個(gè)蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組間數(shù)據(jù)資料運(yùn)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性則兩兩比較采用Bonferronic法，若方差不齊將采用Welch法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泊那替尼對(duì)細(xì)胞增殖的影響 10 μmol/L的泊那替尼即可抑制KBM5R細(xì)胞的增殖(P<0.01)，IC50=16.07 μmol/L，見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)選擇20 μmol/L的泊那替尼用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。P組加入20 μmol/L的泊那替尼處理細(xì)胞，Pr組加入20 μmol/L泊那替尼和1 μg/mL rhNF-κB共同處理細(xì)胞，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，P組的細(xì)胞增殖能力顯著低于C組(P<0.01)，Pr組細(xì)胞的增殖能力顯著高于P組(P<0.01)，見(jiàn)圖2、表1。

*P<0.01 vs C組

*與C組比較P<0.01; #與P組比較P<0.01

表1 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

2.2 泊那替尼對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33258染色結(jié)果提示P組細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著高于C組(P<0.01)，加入rhNF-κB干預(yù)后，Pr組KBM5R細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著低于P組(P<0.01)，見(jiàn)圖3～4、表2。

2.3 泊那替尼對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 DCFH-DA結(jié)果提示P組細(xì)胞中ROS的水平顯著高于C組(P<0.01)，加入rhNF-κB干預(yù)后，Pr組KBM5R細(xì)胞中ROS的水平顯著低于P組(P<0.01)，見(jiàn)圖5～6、表3。

箭頭所指為Hoechst33258染色中呈高亮藍(lán)色的細(xì)胞

*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

表2 各組細(xì)胞的凋亡水平

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

2.4 泊那替尼對(duì)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響 P組細(xì)胞內(nèi)Caspase3的表達(dá)水平顯著高于C組(P<0.01)，Bcl-2/Bax的表達(dá)水平顯著低于C(P<0.01)，給予rhNF-κB干預(yù)可顯著降低Pr組細(xì)胞內(nèi)Caspase3的表達(dá)水平，增加Bcl-2/Bax(P<0.01)，見(jiàn)圖7～8、表4。

2.5 泊那替尼對(duì)細(xì)胞內(nèi)Notch信號(hào)通路的影響 P組細(xì)胞內(nèi)Notch1、Hes1和VEGF的表達(dá)均顯著低于C組(P<0.01)，給予rhNF-κB干預(yù)后，Pr組細(xì)胞內(nèi)Notch1、Hes1和VEGF的表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖9～10、表5。

3 討論

TKIs可特異性地抑制BCR-ABL激酶，從而靶向治療CML，大大延長(zhǎng)患者的生存期，BCR-ABL激酶區(qū)突變是導(dǎo)致CML患者對(duì)TKIs產(chǎn)生耐藥的主要原因。Mat等[11]研究發(fā)現(xiàn)T315I突變可有效降低伊馬替尼、達(dá)沙替尼等與BCR-ABL蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，使得ABL激酶與藥物的結(jié)合被阻斷，進(jìn)而出現(xiàn)耐藥。T315I突變導(dǎo)致蘇氨酸315突變至異亮氨酸，破壞氫鍵，進(jìn)而使得蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生改變[12]。泊那替尼作為第3代TKIs類(lèi)藥物，Ⅱ期臨床研究結(jié)果提示T315I突變的CML患者使用泊那替尼可達(dá)到70%以上的細(xì)胞遺傳學(xué)緩解，可有效治療T315I突變的難治性CML[13]。本研究選擇T315I突變的CML細(xì)胞株KBM5R進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泊那替尼可有效抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

圖5 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的顯微圖

*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

表3 各組細(xì)胞的ROS水平

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

圖7 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(蛋白條帶圖)

A：Caspase3蛋白統(tǒng)計(jì)圖；B：Bcl-2/Bax統(tǒng)計(jì)圖;*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

圖8Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

組別Caspase 3/GAPDHBcl-2/BaxC組0.98±0.080.94±0.04P組1.54±0.17*0.42±0.09*Pr組1.28±0.10△0.73±0.06△

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

圖9Westernblot檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(蛋白條帶圖)

A：Notch1蛋白統(tǒng)計(jì)圖；B：Hes1蛋白統(tǒng)計(jì)圖；C：VEGF蛋白的統(tǒng)計(jì)圖；*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

圖10Westernblot檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

組別Notch1/GAPDHHes1/GAPDHVEGF/GAPDHC組0.91±0.070.66±0.080.98±0.07P組0.39±0.10*0.28±0.06*0.49±0.04*Pr組0.81±0.04△0.86±0.05△0.84±0.05△

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

Notch信號(hào)通路是存在于多種生物體內(nèi)的高度保守的信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的多個(gè)生理過(guò)程，與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等密切相關(guān)[14]；相鄰細(xì)胞間的Notch受體與配體相互結(jié)合可啟動(dòng)Notch信號(hào)通路，進(jìn)而激活下游靶蛋白Hes1的表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)作用[15]。值得注意的是，Notch信號(hào)通路在不同的組織中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用并不完全相同，Butko等[16]研究認(rèn)為Notch信號(hào)通路可有效促進(jìn)正常造血干細(xì)胞的自我更新，發(fā)揮維持干性的作用，有效抑制干細(xì)胞向其他細(xì)胞分化；同時(shí)，大量的研究證據(jù)提示抑制Notch信號(hào)的激活可有效抑制急性髓系白血病細(xì)胞的增殖，使得急性髓系白血病細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、凋亡[17-18]；Sengupta等[19]發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在急性期的CML患者中被激活的比例增加，急性期CML患者體內(nèi)Hes1的表達(dá)顯著增加；上述的結(jié)果均提示Notch信號(hào)通路及靶基因Hes1可調(diào)控髓系白血病進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)泊那替尼可有效降低KBM5R細(xì)胞中Notch1和Hes1的表達(dá)，抑制Notch信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，增加細(xì)胞凋亡。同時(shí)采用Notch信號(hào)通路激動(dòng)劑rhNF-κB激活Notch后，細(xì)胞的增殖顯著增加，凋亡的數(shù)量顯著降低。Kannan等[20]研究認(rèn)為激活骨髓中Notch信號(hào)通路的激活會(huì)顯著增加高危急性髓系白血病患者不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號(hào)通路可顯著降低VEGF的表達(dá)，該結(jié)果提示泊那替尼通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路，進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)KBM5R細(xì)胞凋亡的作用。Ikram等[21]研究認(rèn)為血管發(fā)育及新生與多種血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)。

綜上所述，泊那替尼通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路，降低VEGF的表達(dá)，增加T315I突變的CML細(xì)胞中ROS的水平，增加凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮治療T315I突變CML患者的作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步揭示CML細(xì)胞出現(xiàn)T315I突變的機(jī)制，為T(mén)315I突變CML患者的治療藥物選擇提供理論依據(jù)。