王鑫洋，陶 輝，丁季飛，徐盛松，石開虎

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 1.心胸外科，2. 心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以血糖升高為特征的代謝性疾病，它最終能導致各種組織，包括腎、眼、心臟等一系列血管并發(fā)癥的發(fā)生[1]。心肌纖維化是一種常見的纖維化過程，其參與了心衰、房顫等多種心臟器質性病理損傷過程[2-3]。糖尿病致心肌纖維化是導致糖尿病心肌病的重要病理過程之一[4]，在心肌纖維化過程中，心肌成纖維細胞和膠原蛋白等細胞外基質起到了重要作用[5]。MicroRNA是一類長為22～23個核苷酸的內源性非編碼小RNA，通過對mRNA 3′-端非編碼區(qū)的不完全互補結合，對其蛋白表達水平進行調節(jié)，從而參與許多重要的生理病理過程的調控[6]。其中miR-200b[7]、miR-29[8]、miR-21[9]在心肌纖維化的膠原沉積中有重要作用。有報道稱，miR-152能減弱DNMT1介導的甲基化，從而抑制肝纖維化[10]，但其在心臟疾病中尚未見報道。本研究通過動物實驗和細胞實驗，旨在探究miR-152對糖尿病心肌病的影響，為治療和干預糖尿病心肌病，延緩心肌纖維化過程，提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 40只健康成年SD ♂大鼠，體質量(160～200) g；出生1～3 d的60只健康SD乳鼠，體質量(15～25) g，均購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心，動物許可證號：SYXK(皖)2017-006。

1.1.2試劑 鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)、MTT試劑盒，均購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；U6 qPCR試劑盒、miR-152模擬物(上海吉瑪公司)；逆轉錄引物(上海生工生物工程公司)；胰蛋白酶(美國WISENT公司)；β-actin多克隆抗體、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)多克隆抗體、Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ，Collagen Ⅰ)多克隆抗體(武漢博士德生物公司)。

1.1.3儀器 EPS 300電泳儀、轉膜儀(Tanon)；顯影儀、實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；varioskan LUX酶標儀(Thermo Scientific)；ZHJH-C1112C超凈工作臺(智城)；生物安全柜(海爾)。

1.2 方法

1.2.1建立SD大鼠糖尿病模型 將40只大鼠隨機分為對照組和糖尿病組，每組各20只。糖尿病組1次性腹腔注射STZ，分別在注射后的d 3與d 7，通過大鼠尾靜脈取血測血糖，如果兩次血糖均高于11.1 mmol·L-1，則認為大鼠造模成功。對照組注射等量生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)12周后，麻醉后處死大鼠，解剖出大鼠心臟，取部分心肌組織，多聚甲醛固定后石蠟切片，分組行HE和Masson染色，觀察心肌組織和心肌纖維化程度。剩余部分心肌組織提取蛋白和RNA，分別行Western blot檢測各組α-SMA和Collagen Ⅰ的表達，qPCR檢測各組miR-152的表達。

1.2.2乳鼠原代心肌成纖維細胞的提取和培養(yǎng) 將出生1～3 d健康乳鼠浸泡在75%酒精消毒后處死，在無菌操作臺用眼科剪、鑷子解剖出完整的小鼠心臟，去除心臟表面脂肪組織、結締組織后，用無菌預冷的PBS漂洗3遍，洗凈表面血液，轉移至新的EP管中，小心剪成1 mm3大小組織塊，加入胰蛋白酶和膠原酶(比例為2 ∶1)的混合液，在37 ℃水浴鍋中充分震蕩消化15 min，用細胞篩過濾后取上層清液，加入等量的DMEM培養(yǎng)基終止消化后，900 r·min-1離心10 min，小心棄去上清液，用含血清的DMEM培養(yǎng)基吹散細胞沉淀，轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育90 min后換液，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，此時貼壁的即為心肌成纖維細胞。而后繼續(xù)培養(yǎng)至3～4代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3miR-152的轉染 用細胞計數板計數心肌成纖維細胞，計數后等量接種于6孔板，次日待各孔中細胞密度達到70%～80%后進行轉染。按照說明書配成miR-152模擬物原液，吸取10 μL，加入500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基混勻后備用；吸取LipofectamineTM2000 10 μL，加入500 μL Opti-MEM混勻后備用；將上述兩種混合液混勻后，配成miR/LipofectamineTM2000復合物，靜置30 min后加入6孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后換成正常培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48～72 h后提取RNA和蛋白質，進行下一步實驗。

1.2.4細胞分組及處理 將正常細胞及轉染后的細胞分別行高糖(葡萄糖濃度33.3 mmol·L-1)和低糖(葡萄糖濃度5.5 mmol·L-1)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48 h后提取蛋白質和總RNA，分別行Western blot和qPCR。

1.2.5Western blot檢測組織和細胞中的目的蛋白 分別取心肌組織和細胞，置于冰上，加入RIPA裂解液和PMSF，離心后，取上清液測量蛋白濃度，而后加入蛋白上樣緩沖液100 ℃加熱5 min。冷卻后SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，8%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃搖床孵育α-SMA、Collagen Ⅰ一抗過夜，次日分別加二抗室溫孵育1 h后，采用ECL法，以β-actin為內參，檢測目的蛋白的表達。

1.2.6qPCR檢測miR-152的表達 待轉染24 h后，使用TRIzol法提取總RNA，按如下步驟：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min進行逆轉錄，得到cDNA。按如下步驟行qPCR檢測miR-152的表達：預變性95 ℃ 10 min；變性：95 ℃ 20 s，退火：62 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)的擴增；熔解曲線階段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。最后用U6作為內參，根據2-ΔΔCT法計算各組mRNA的相對表達水平。按如下步驟行qPCR檢測α-SMA和Collagen Ⅰ的表達:預變性階段50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；擴增階段95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)；熔解曲線階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s 。以β-actin為內參，根據2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.7MTT檢測心肌成纖維細胞增殖 取轉染后的細胞，調整細胞濃度至1×108·L-1，而后按每孔100 μL接種于96孔板中。在培養(yǎng)24、48 h后，加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄液體，加入150 μL DMSO，搖床孵育10 min后，測量490 nm處吸光度值。

2 結果

2.1 大鼠心臟標本病理學變化心肌細胞在HE染色中為紫紅色，而細胞核為紫藍色。如Fig 1所示，對照組心肌細胞排列規(guī)則，大小形態(tài)正常；糖尿病組心肌細胞排列雜亂，膠原明顯增多，細胞體積增大。Masson染色顯示心肌細胞為紫紅色，藍黑色部分為細胞核，心肌間質膠原纖維為紫藍色。對照組心肌細胞排列整齊，大小正常；糖尿病組中膠原纖維增多，細胞大小不一，結構消失。

2.2 大鼠糖尿病組和對照組心肌標本α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達變化如Fig 2所示，糖尿病組大鼠心肌標本中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達量較對照組明顯增高(P<0.05)。

Fig 1 HE and Masson staining(×200)

Fig 2 Expression of α-SMA and collagen Ⅰ in heart tissue of STZ

2.3 大鼠糖尿病心肌標本中miR-152的表達變化qPCR檢測結果如Fig 3所示，糖尿病組大鼠心肌組織中miR-152的表達明顯低于對照組(P<0.05)。

2.4 高糖處理乳鼠原代心肌成纖維細胞中miR-152的表達變化應用高糖處理乳鼠原代心肌成纖維細胞，如Fig 4所示，經過高糖刺激24 h后，miR-152的表達明顯降低(P<0.05)。

Fig 3 Expression of miR-152 in heart

Fig 4 Expression of miR-152 in SD

2.5 乳鼠原代心肌成纖維細胞轉染結果轉染miR-152模擬物后培養(yǎng)24 h，檢測miR-152的表達。如Fig 5所示，與對照組相比，miR-152模擬物組的miR-152含量明顯增多(P<0.01)。

Fig 5 Expression of miR-152 after transfect

2.6 miR-152模擬物對乳鼠心肌成纖維細胞中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白表達的影響如Fig 6所示，轉染miR-152模擬物后，α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達量較空白組和陰性對照組明顯降低(P<0.05)。

Fig 6 Protein expression of collagenⅠand

2.7 miR-152對細胞增殖的影響如Fig 7所示，在轉染后24、48 h行MTT檢測，結果顯示，miR-152模擬物組的心肌成纖維細胞增殖水平較空白對照組和陰性對照組明顯降低(P<0.05)。

Fig 7 Level of proliferation of CFs after

3 討論

糖尿病是臨床上常見的代謝性疾病，由于其并發(fā)癥眾多，常常可以引起諸如心腦血管、眼底、神經等多器官的損傷。其中，糖尿病心肌病是糖尿病的重要并發(fā)癥，而糖尿病心肌病的特征性病理變化是心肌纖維化，可導致心功能不全，甚至心衰[11-12]。心臟的細胞主要由心肌細胞和其周圍的心肌成纖維細胞構成[13]。心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中，心肌成纖維細胞和膠原分泌增多發(fā)揮著重要作用。高血糖的糖基化終末產物可誘導心肌成纖維細胞增殖，從而導致心肌重構[14]。

微小RNA(microRNA，miR)是一類由內源基因編碼的，高度保守的非編碼單鏈RNA小分子，由18～25個核苷酸構成。通過對功能蛋白的信使RNA(message RNA，mRNA)進行降解或翻譯抑制，對其蛋白表達水平進行調節(jié)，從而參與許多重要的生理病理過程的調控。研究表明，miR-152參與纖維化疾病發(fā)生、發(fā)展，然而，miR-152在糖尿病心肌病中起何作用仍未明確。本課題通過建立糖尿病動物模型以及高糖細胞模型，探究miR-152在糖尿病心肌病中的調節(jié)作用及可能機制。動物實驗表明，糖尿病組心肌組織相較于對照組膠原明顯增加，細胞排列紊亂。Western blot結果表明，糖尿病組α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達量較對照組明顯增高。qPCR結果表明，糖尿病組miR-152表達明顯低于對照組。細胞實驗表明，經過高糖刺激后，qPCR結果表明miR-152的表達較低糖組明顯降低；心肌成纖維細胞轉染miR-152模擬物后，α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表達量較空白組和陰性對照組相比明顯降低；同時，MTT結果顯示，CFs轉染miR-152模擬物后，心肌成纖維細胞的增殖活性明顯降低。

綜上所述，miR-152的高表達可降低α-SMA和Collagen Ⅰ等相關心肌纖維化蛋白的表達，從而抑制心肌纖維化的發(fā)生?？梢詾轭A防心肌纖維化和延緩其相關疾病，如糖尿病心肌病的進展，甚至逆轉其病理改變提供新的思路。

(致謝：本實驗在安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心實驗室完成，感謝各位老師和同學的幫助和耐心指導。)