史利歡，田 亮，黃 閃，劉俊閃，王亞峰，栗春香，劉 煒

[(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院(河南省小兒血液醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),河南 鄭州 450000)]

伊馬替尼(imatinib，IM)作為酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，可通過競(jìng)爭(zhēng)性與酪氨酸激酶結(jié)合，阻斷三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)對(duì)酪氨酸激酶的活化作用進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]，其被廣泛應(yīng)用于治療Ph(+)的急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)及慢性髓細(xì)胞白血病，可明顯提高患者臨床療效及預(yù)后水平[2]，但相當(dāng)部分的患者會(huì)在5年內(nèi)發(fā)生繼發(fā)TKI耐藥[3]，嚴(yán)重影響治療效果，因此明確IM耐藥發(fā)生的機(jī)制對(duì)于Ph(+)的ALL患者的治療具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度>200nt的非編碼RNA，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮廣泛且復(fù)雜的生物學(xué)作用，LncRNA HIT(HOXA transcript induced by TGFβ，HIT)近年被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤細(xì)胞惡性行為及進(jìn)展相關(guān)[4-5]，但其在ALL中的生物學(xué)作用尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)及體外實(shí)驗(yàn)等多種手段對(duì)HIT與ALL IM抵抗的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探究，情況如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng)人ALL細(xì)胞SUP-B15(美國ATCC，CRL-1929)，人胚胎腎細(xì)胞293T(美國ATCC，CRL-3216)，培養(yǎng)SUP-B15細(xì)胞采用10%胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco)+ 100 U·mL-1青霉素(天津藥業(yè)焦作有限公司)+100 μg·mL-1鏈霉素(國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司)的 RPMI1640(美國Thermo Fisher Scientific)培養(yǎng)液；培養(yǎng)293T細(xì)胞采用10% FBS+100 U·mL-1青霉素+100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM(美國Gibco)培養(yǎng)液。培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃，5% CO2及100%相對(duì)濕度，SUP-B15細(xì)胞室溫，1 000 rpm離心(fresco17，美國Thermo Fisher Scientific)5 min，每24 h更換培養(yǎng)液，原代細(xì)胞按1 ∶2分種傳代。

1.2 SUP-B15 IM抵抗細(xì)胞株(IM resistance，IMR)及對(duì)照組(Control)細(xì)胞株的構(gòu)建1 ∶2分種傳代SUP-B15細(xì)胞，將細(xì)胞分為IMR及Control兩組，IMR組細(xì)胞采用0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 μmol·L-1IM(美國Selleck，S2475b)分步誘導(dǎo)，在每個(gè)IM濃度梯度下維持培養(yǎng)2周以上，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，進(jìn)入下一濃度的篩選，直至細(xì)胞在4 μmol·L-1IM中可維持生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1周后完成IMR組細(xì)胞株的構(gòu)建。同時(shí)采用等體積生理鹽水處理SUP-B15細(xì)胞作為本研究的Control細(xì)胞株。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染敲降IMR細(xì)胞HIT的表達(dá)慢病毒包裝表達(dá)靶向LncRNA HIT的shRNA 1#及2#載體(蘇州吉瑪基因公司)，1 ∶2分種傳代293T細(xì)胞，接種至6孔板中，分別編號(hào)為1#及2#兩組，另取2支1.5 mL 離心管(德國Eppendorf)并編號(hào)，每管加入500 μL DMEM、1.5 μg Gag-Pol Rev expression vector(美國Addgene)及3.0 μg VSV-G expression vector(美國Addgene)，并分別加入靶向LncRNA HIT的shRNA 1#及2#載體，充分混勻后室溫靜置5 min，加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher Scientific)10 μL，充分混勻后室溫靜置20 min，PBS處理293T細(xì)胞3次，加入1 mL DMEM，緩慢均勻加入離心管中的混合液，6 h后PBS處理293T細(xì)胞3次，加入3 mL 10% FBS+DMEM培養(yǎng)液，48 h后收集上清液并過濾。將上清液與10% FBS+RPMI1640 1 ∶1混合后培養(yǎng)IMR細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3 d后，0.5 mg·L-1嘌呤霉素篩選細(xì)胞至其生長(zhǎng)狀態(tài)良好，完成IMR shHIT1#及2#兩組細(xì)胞的構(gòu)建。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞IM半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)培養(yǎng)待檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，T20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Bio-Rad)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種待測(cè)細(xì)胞于96孔板中，細(xì)胞懸液總體積100 μL，設(shè)置0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol·L-1不同濃度的梯度IM，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔及空白對(duì)照孔，以相應(yīng)濃度IM處理96孔板中的細(xì)胞24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)，并充分混勻，37 ℃，5% CO2條件下孵育2 h，SynergyH1酶標(biāo)儀(美國Biotek)檢測(cè)各樣本450 nm處吸光度，以空白孔調(diào)零，計(jì)算各孔的相對(duì)吸光度。

1.5 熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中RNA表達(dá)水平收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1×106左右的待檢測(cè)細(xì)胞， 1 mL TRIzol試劑(美國Invitrogen)重懸細(xì)胞抽提細(xì)胞總RNA，Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific)檢測(cè)RNA濃度，1 μg RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific Fermentas)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，配置合成LncRNA HIT、QKI、腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)標(biāo)志物Oct4及Sox2基因qPCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司，詳細(xì)序列情況見Tab 1)至工作濃度0.5 μmol·L-1，采用 SYBR Premix Ex Taq II核酸染料(日本TaKaRa)20 μL體系于Lightcycler-480Ⅱ熒光定量PCR儀(瑞士Roche)中進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每組設(shè)置重復(fù)孔3個(gè)，GAPDH作為內(nèi)參基因，2(-△△CT)法計(jì)算LncRNA HIT、QKI、Oct4及Sox2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

Tab 1 The primer sequence of LncRNA HIT, QKI,

1.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期5×106左右的待檢測(cè)細(xì)胞，500 μL Ripa蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司)4 ℃裂解細(xì)胞1 h，15 000 r·min-1，4 ℃離心細(xì)胞10 min，收集上清液于1.5 mL 離心管，BCA蛋白定量試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)檢測(cè)總蛋白濃度，與聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)緩沖液配置成2 g·L-1體系，煮沸變性-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?5%聚丙烯酰胺凝膠，行PAGE，穩(wěn)壓120 V，轉(zhuǎn)PVDF膜(美國Millipore)穩(wěn)流300 mA，10%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜2 h，剪取目的條帶，1 ∶1 000的QKI抗體(anti-QKI，美國Abcam，ab126742)；Oct4抗體(anti-Oct4，美國Abcam，ab18976)；Sox2抗體(anti-Sox2，美國Abcam，ab97959)；GAPDH抗體(anti-GAPDH，美國Abcam，ab70699)室溫孵育目的蛋白分子量所對(duì)應(yīng)的條帶3 h，PBS洗條帶3次后1 ∶2 000山羊抗兔IgG(sheep polyclonal to rabbit IgG H&L，美國Abcam，ab6795)室溫孵育條帶1 h，PBS洗條帶3次后ECL化學(xué)發(fā)光底物(美國Thermo Pierce)孵育條帶，ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)對(duì)條帶印跡進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié)果

Tab 2 Expression of LncRNA HIT, QKI, Oct4 and Sox2 mRNA in control, IMR, IMR shHIT1# and 2# cells

2.1 Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞IM IC50的比較Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞IM IC50分別為0.458±0.032、2.963±0.260、1.531±0.128及1.209±0.112 μmol·L-1，其中IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞IM IC50明顯高于Control細(xì)胞(F=34.31，ControlvsIMR q1=13.89，ControlvsshHIT1# q2=7.37，ControlvsshHIT2# q3=4.16，P均<0.05)，且IMR shHIT1#及2#細(xì)胞IM IC50明顯低于IMR細(xì)胞(IMRvsshHIT1# q4=9.73，IMRvsshHIT2# q5=6.52，P均<0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Comparison of IC50 to IM of control, IMR,IMR shHIT1# and 2# cells

2.2 Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞LncRNA HIT、QKI、Oct4及Sox2 mRNA表達(dá)水平及比較Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞LncRNA HIT、QKI、Oct4及Sox2 mRNA表達(dá)水平情況見Tab 2，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，IMR細(xì)胞LncRNA HIT表達(dá)水平明顯高于Control細(xì)胞，IMR shHIT1#及2#細(xì)胞LncRNA HIT表達(dá)水平明顯低于IMR及Control細(xì)胞(F=56.97，ControlvsIMR q1=12.95，ControlvsshHIT1# q2=4.63，ControlvsshHIT2# q3=6.32，IMR vs shHIT1# q4=14.12，IMRvsshHIT2# q5=16.33)；IMR細(xì)胞、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞QKI mRNA表達(dá)水平明顯低于Control細(xì)胞，而IMR shHIT1#及2#細(xì)胞QKI mRNA表達(dá)水平與IMR細(xì)胞相比無明顯變化(F=44.21，ControlvsIMR q1=13.17，ControlvsshHIT1# q2=11.52，ControlvsshHIT2# q3=13.84，IMRvsshHIT1# q4=2.38，IMRvsshHIT2# q5=1.71)；IMR細(xì)胞、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞Oct4 mRNA表達(dá)水平明顯高于Control細(xì)胞，IMR shHIT1#及2#細(xì)胞Oct4 mRNA表達(dá)水平明顯低于IMR細(xì)胞(F=30.42，ControlvsIMR q1=13.32，ControlvsshHIT1# q2=6.23，ControlvsshHIT2# q3=4.70，IMRvsshHIT1# q4=7.08，IMRvsshHIT2# q5=8.62)；IMR細(xì)胞、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞Sox2 mRNA表達(dá)水平明顯高于Control細(xì)胞，IMR shHIT1#及2#細(xì)胞Sox2 mRNA表達(dá)水平明顯低于IMR細(xì)胞(F=54.57，ControlvsIMR q1=17.47，ControlvsshHIT1# q2=5.00，ControlvsshHIT2# q3=5.97，IMR vs shHIT1# q4=12.47，IMRvsshHIT2# q5=11.50)。

2.3 Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞QKI、Oct4及Sox2蛋白表達(dá)水平及比較Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞Oct4及Sox2蛋白表達(dá)水平變化與mRNA水平一致，IMR細(xì)胞、IMR shHIT1#及2#細(xì)胞QKI蛋白表達(dá)水平明顯低于Control細(xì)胞，而IMR shHIT1#及2#細(xì)胞QKI蛋白表達(dá)水平明顯高于IMR細(xì)胞，見Fig 2。

Fig 2 Expression of QKI, Oct4 and Sox2 protein in control,IMR, IMR shHIT1# and 2# cells

3 討論

LncRNA HIT基因定位于HOXA基因簇中，受轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的明顯調(diào)控，在胚胎未分化的肢體、器官等組織中表達(dá)，并參與哺乳動(dòng)物的軟骨分化[6]，近年許多研究指出，HIT在多種惡性腫瘤中表達(dá)重新上調(diào)，并參與其發(fā)生發(fā)展：Richards等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)LncRNA HIT參與TGF-β誘導(dǎo)的乳腺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，敲除HIT的表達(dá)后，TGF-β介導(dǎo)的小鼠乳腺癌細(xì)胞NMuMG侵襲、遷移能力均明顯下調(diào)，提示HIT在乳腺癌的EMT調(diào)節(jié)和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；Jia等[4]發(fā)現(xiàn)，HIT在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，且HIT表達(dá)水平與患者總生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，與患者臨床分級(jí)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率正相關(guān)，體外通過慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建過表達(dá)及shRNA敲降HIT的A549及SK-MES-1細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)HIT可通過維持ZEB-1蛋白的穩(wěn)定，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及EMT；Yu等[5]發(fā)現(xiàn)，LncRNA HIT過表達(dá)或敲降可明顯增加或減少NSCLC細(xì)胞增殖能力，同時(shí)明確其與轉(zhuǎn)錄因子E2F1的相互作用，進(jìn)而對(duì)下游靶基因調(diào)控，發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌增殖的作用；李鑄鵬等[8]的研究顯示，LncRNA HIT在侵襲性乳腺癌組織中表達(dá)明顯升高，且與早期NSCLC患者復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)，表明了HIT與NSCLC耐藥性及發(fā)生發(fā)展具有潛在聯(lián)系。但目前有關(guān)HIT在血液腫瘤中的生物學(xué)研究仍是空白，而在前期研究中，我們通過生物信息學(xué)(http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA HIT與抑癌因子RNA結(jié)合蛋白Quaking(QKI)存在潛在的相互結(jié)合，暗示了HIT可能通過調(diào)控QKI在血液腫瘤中發(fā)揮作用。

QKI近年被許多研究報(bào)道可作為重要的抑癌因子影響多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展：Zong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，QKI在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，并與患者預(yù)后時(shí)間相關(guān)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)QKI可抑制肺癌細(xì)胞的惡性增殖，其作用機(jī)制與阻滯Notch信號(hào)通路的激活有關(guān)；Zhao等[10]研究顯示，QKI在前列腺癌組織中表達(dá)明顯降低，且其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度、患者TNM分期及總生存率密切相關(guān)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QKI可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖及成瘤能力；He等[11]發(fā)現(xiàn)QKI在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，且受到微小RNA-155(MicroRNA-155)的負(fù)相調(diào)控，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑制細(xì)胞周期和侵襲的作用；Lu等[12]研究發(fā)現(xiàn)QKI在口腔癌組織及口腔癌干細(xì)胞系中低表達(dá)，體外及裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示QKI可通過特異性結(jié)合Sox2基因3'UTR區(qū)域阻滯Sox2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制口腔癌細(xì)胞CSCs特性及惡性表型。QKI同樣被發(fā)現(xiàn)與血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有潛在聯(lián)系：Fang等[13]發(fā)現(xiàn)QKI是紅細(xì)胞成熟的關(guān)鍵分子，提示QKI對(duì)造血干細(xì)胞的正常分化具有重要意義，同時(shí)，Tili等[14]發(fā)現(xiàn)慢性B型淋巴細(xì)胞性白血病患者腫瘤細(xì)胞中QKI表達(dá)水平明顯下調(diào)，且通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)QKI的表達(dá)與白血病的進(jìn)展明顯負(fù)相關(guān)。而CSCs則可通過原癌信號(hào)通路的激活及抗凋亡等多種途徑促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞包括IM在內(nèi)的多種藥物抵抗的發(fā)生[15]。由此我們提出假設(shè)：HIT是否可通過調(diào)控QKI的表達(dá)進(jìn)而影響ALL細(xì)胞CSCs表型發(fā)揮生物學(xué)作用。

本研究在IM抵抗Ph(+)的ALL細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)LncRNA HIT表達(dá)的上調(diào)，提示HIT可能參與ALL細(xì)胞IM抵抗的發(fā)生，而采用shRNA下調(diào)IM抵抗細(xì)胞中HIT的表達(dá)后，細(xì)胞IM IC50明顯降低，表明HIT對(duì)ALL細(xì)胞IM抵抗具有促進(jìn)作用，但shHIT1#及2#細(xì)胞IM IC50仍高于Control細(xì)胞，推測(cè)是由于ALL細(xì)胞IM抵抗的發(fā)生可能涉及多條信號(hào)通路，而HIT僅作為其中重要的一部分參與IM抵抗的發(fā)生。為了進(jìn)一步明確HIT發(fā)揮生物學(xué)作用的相關(guān)機(jī)制，我們對(duì)可能的相互作用分子QKI的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IM抵抗的ALL細(xì)胞中QKI mRNA及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示QKI表達(dá)的下調(diào)與ALL細(xì)胞IM抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，結(jié)合生物學(xué)分析結(jié)果，我們推測(cè)HIT可能與QKI存在相互作用，共同影響ALL細(xì)胞的IM抵抗，因此，我們?cè)趕hHIT1#及2#細(xì)胞中檢測(cè)了QKI的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲降HIT后，QKI mRNA表達(dá)水平無變化，而蛋白表達(dá)升高，表明HIT可通過負(fù)調(diào)控QKI蛋白表達(dá)水平，影響ALL細(xì)胞IM抵抗?；赒KI與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的緊密關(guān)系，我們對(duì)相關(guān)分子Oct4及Sox2表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在IM抵抗的ALL細(xì)胞中Oct4及Sox2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，提示IM抵抗與ALL細(xì)胞干細(xì)胞特性密切相關(guān)，而敲降HIT后Oct4及Sox2 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，表明HIT對(duì)于Oct4及Sox2的表達(dá)存在正調(diào)控作用。

綜上，我們的研究表明HIT可通過抑制ALL細(xì)胞QKI蛋白水平的表達(dá)，上調(diào)CSCs相關(guān)分子Oct4及Sox2，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞IM抵抗能力。接下來我們將進(jìn)一步探究HIT與QKI蛋白的相互結(jié)合及調(diào)控機(jī)制，并采用細(xì)胞及動(dòng)物模型明確HIT在ALL中的生物學(xué)效應(yīng)，為相關(guān)診斷試劑及靶向藥物在血液腫瘤中的開發(fā)及應(yīng)用提供新的標(biāo)志物。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河南省小兒血液醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝馬平、李晶、陳靜、謝昕對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)及幫助)。