盧世姝，蔣文艷，佘美華， 楊 娟，張 瑤，尹衛(wèi)東

(1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.邵陽(yáng)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，湖南 邵陽(yáng) 422000)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)的主要特征和前期表現(xiàn)，是多種原因所導(dǎo)致的組織或靶細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性和/或反應(yīng)性降低，表現(xiàn)為外周組織尤其是肝臟、肌肉、脂肪組織等對(duì)葡萄糖的攝取和利用障礙。作為胰島素信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子，Akt(PKB)一方面使糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3β磷酸化(如Ser9)而失活，導(dǎo)致下游的糖原合酶(glycogen synthase，GS)活化，促進(jìn)糖原的合成[1]；同時(shí)Akt使叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box-O1，F(xiàn)oxO1)磷酸化并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，失去其激活糖異生相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄的活性，結(jié)果抑制糖異生[2]。研究表明褪黑素(melatonin，MLT)與機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持有關(guān)[3]，如隨著年齡的增長(zhǎng)褪黑素水平降低，而IR和T2D則呈上升趨勢(shì)?；诖?，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)建立HepG2 IR細(xì)胞模型，以此研究MLT對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖代謝的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；MLT由Neurim Pharmaceuticals公司提供；胎牛血清(FBS)、胰島素、DAPI等為Sigma公司產(chǎn)品，兔抗人p-Akt(Ser473)(貨號(hào)：4060s)、p-GSK(Ser9)(9323P)、FoxO1(2880p)及p-FoxO1(Ser256)(9461P)一抗均為CST產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(sc-2012)購(gòu)于北京博奧森公司。酶標(biāo)儀(Millipore 公司)，熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理HepG2細(xì)胞采用L-DMEM (10% FBS)培養(yǎng)液、37℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，轉(zhuǎn)入6孔板，并分為對(duì)照組 (control)和IR模型組(IR)，分別以含葡萄糖(5.5 mmol·L-1)或高糖(25 mmol·L-1)高胰島素(1 μmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)24 h；IR組再用含MLT(10 nmol·L-1)或生理鹽水的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h。

1.3 葡萄糖消耗為檢測(cè)細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激下的葡萄糖攝取，各組分別換為含胰島素(0或100 nmol·L-1)的無血清低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，各自以未接種細(xì)胞的空白孔作對(duì)照，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計(jì)算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.4 糖原含量測(cè)定PBS洗滌后用胰酶消化并離心收集各組細(xì)胞，按糖原檢測(cè)試劑盒說明加入堿液300 μL以破壞其他成分而保留糖原，雙蒸水定容，加入顯色液，沸水浴5 min，冷卻后于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，計(jì)算出糖原含量。

1.5 Western blot分析冷PBS漂洗3次后裂解細(xì)胞，常規(guī)方法提取總蛋白，BCA法定量，沸水中煮5 min后上樣電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫下封閉2 h，p-Akt、p-GSK、FoxO1、p-FoxO1一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，顯影。

1.6 細(xì)胞免疫熒光分析將蓋玻片置于6孔板，使細(xì)胞爬片培養(yǎng)并分組處理，4%多聚甲醛固定，通透10 min(Triton-X100)，1% BSA封閉30 min，F(xiàn)oxO1一抗(1 ∶100)4℃過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗 (1 ∶100)室溫孵育40 min，DAPI避光染核5 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 MLT促進(jìn)IR HepG2細(xì)胞葡萄糖的攝入各組細(xì)胞葡萄糖的基礎(chǔ)攝入(無胰島素作用)或消耗量無顯著差異。胰島素刺激后，對(duì)照組葡萄糖消耗量增加了78%(P<0.01)；IR組細(xì)胞糖消耗量雖也有增加，但明顯低于對(duì)照組P<0.01，而胰島素抵抗組經(jīng)MLT處理后，葡萄糖消耗量較IR組有明顯提高(P<0.01，F(xiàn)ig 1)。

2.2 MLT對(duì)IR HepG2細(xì)胞糖原含量的影響Fig 2顯示：IR組細(xì)胞糖原含量?jī)H為對(duì)照組細(xì)胞的14%(P<0.01)，但經(jīng)MLT處理后其糖原含量明顯增加，約為IR組細(xì)胞的3倍以上(P<0.01)。提示MLT能提高胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下細(xì)胞的糖原合成。

2.3 MLT對(duì)Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響蛋白分析顯示：與對(duì)照組相比，IR組細(xì)胞p-Akt和p-GSK-3β蛋白水平明顯降低(P<0.01)，分別降低了約23%和30%；而該胰島素抵抗模型細(xì)胞經(jīng)MLT處理后，其p-Akt和p-GSK-3蛋白水平分別增加48%和66%(P<0.01) (Fig 3)。

Fig 1 Reversing of glucose consumption by melatonin in IR HepG2

Fig 2 Effects of melatonin on glycogen synthesis

Fig 3 Effects of melatonin on levels of p-Akt and p-GSK-3β in insulin resistant HepG2

2.4 MLT對(duì)FoxO1蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)位的影響蛋白分析顯示(Fig 4)：與對(duì)照組相比，IR組細(xì)胞p-FoxO1蛋白降低近48%，差異明顯(P<0.01)；經(jīng)過MLT處理后，p-FoxO1蛋白水平與IR組細(xì)胞相比上調(diào)約42%(P<0.01)。免疫熒光監(jiān)測(cè)則顯示胰島素刺激后，對(duì)照組和MLT處理IR細(xì)胞胞質(zhì)中FoxO1蛋白較多，而IR組細(xì)胞質(zhì)FoxO1蛋白則基本無表達(dá)(Fig 5)。

Fig 4 Up-regulation of p-FoxO1 by melatonin in insulin

Fig 5 Level of FoxO1 in cytoplasm in HepG2 cells(40×)

3 討論

肝臟作為胰島素的重要靶器官，參與了胰島素對(duì)糖、脂、蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)，因此肝臟對(duì)胰島素不敏感是IR的重要體現(xiàn)之一。肝細(xì)胞以糖原形式對(duì)葡萄糖進(jìn)行儲(chǔ)存，同時(shí)又通過糖異生作用和糖原分解以補(bǔ)充血糖，即產(chǎn)生內(nèi)源性葡萄糖。抑制肝細(xì)胞葡萄糖的內(nèi)生是胰島素調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的途徑之一，肝胰島素抵抗時(shí)，胰島素的此抑制作用減弱，以致高分泌量的胰島素亦無法代償，最終導(dǎo)致機(jī)體糖代謝紊亂[4-6]。本研究中采用高糖高胰島素培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞對(duì)胰島素介導(dǎo)的糖攝取減少、糖原合成降低(P<0.01)，說明該細(xì)胞對(duì)糖的利用能力減弱，提示細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗。但研究結(jié)果顯示褪黑素逆轉(zhuǎn)了高糖高胰島素的這一作用，提示褪黑素對(duì)高糖高胰島素等胰島素抵抗高危誘導(dǎo)因素下的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。

Akt是胰島素信號(hào)通路中的一個(gè)重要分子，Akt的活化直接參與了肝臟糖原合成與分解以及糖異生的過程。一方面Akt通過Akt/GSK-3β信號(hào)通路調(diào)節(jié)糖原合成并維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)[7]。GSK-3β是一種富含有絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Try)的激酶，胰島素通過PI3K通路可使Akt磷酸化而激活，進(jìn)而使下游靶蛋白GSK-3β 磷酸化而喪失激酶活性，導(dǎo)致糖原合成關(guān)鍵酶GS去磷酸化活化并刺激糖原的合成[1]，從而維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)褪黑素處理的IR HepG2細(xì)胞p-Akt和p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平明顯升高，提示褪黑素可能通過Akt蛋白誘導(dǎo)GSK-3β的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)了肝細(xì)胞葡萄糖的攝取利用和糖原的合成。

FoxO1是Akt的又一靶蛋白，F(xiàn)oxO1蛋白為Fox轉(zhuǎn)錄因子O亞家族成員，是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子。FoxO1有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(如Ser256)，胰島素經(jīng)PI3K/Akt通路使之磷酸化。磷酸化的FoxO1從細(xì)胞核外排至胞質(zhì)，與受調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子的解離使其失去轉(zhuǎn)錄因子的活性。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)是糖異生的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其表達(dá)即受FoxO1轉(zhuǎn)錄激活[2,8-9 ]，因此通過PI3K/Akt/FoxO1下調(diào)它們的表達(dá)是胰島素抑制糖異生的關(guān)鍵。IR時(shí)因PI3K/Akt通路抑制而降低對(duì)FoxO1磷酸化的作用，使得糖異生增強(qiáng)，血糖升高。本研究發(fā)現(xiàn)MLT可以促進(jìn)FoxO1蛋白的磷酸化以及FoxO1蛋白從核轉(zhuǎn)出至胞質(zhì)，同時(shí)磷酸化的Akt水平增高，說明MLT可能通過激活A(yù)kt/FoxO1信號(hào)通路對(duì)肝臟糖異生起到抑制作用，從而減少內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生。

綜上所述，我們認(rèn)為褪黑素一方面通過Akt/GSK-3β途徑促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和糖原合成，同時(shí)又通過Akt/FoxO1通路抑制肝糖異生，從而改善胰島素抵抗和參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。

(本文實(shí)驗(yàn)在南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院完成，所有作者均參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、數(shù)據(jù)分析以及論文撰寫工作。)