高英 周君涵 朱雪瓊

婦科惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的一組惡性疾病[1]。目前對(duì)于婦科惡性腫瘤多采取手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療手段，但由于部分患者未能早期診斷，部分化療藥物易產(chǎn)生耐藥等多種因素[2]，導(dǎo)致治療效果欠佳。因此迫切需要研發(fā)新的靶向化療藥物，從而抑制腫瘤進(jìn)展及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

在新型抗癌藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，需要先進(jìn)行臨床前研究以確保其安全性和有效性，研究的第一步通常是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。目前體外腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)多采用傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方法，其具有成本低、操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)環(huán)境易控制、觀察指標(biāo)較直觀等優(yōu)點(diǎn)。然而，二維培養(yǎng)尚存在較多局限，例如結(jié)構(gòu)過于簡(jiǎn)單，細(xì)胞和細(xì)胞外環(huán)境之間相互干擾，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、極性和分裂方法的變化等[3]。除此之外，在二維培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞常呈單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）接觸很少，缺乏細(xì)胞與細(xì)胞或ECM間的相互作用，與體內(nèi)腫瘤真實(shí)的生長(zhǎng)微環(huán)境存在差異，不能準(zhǔn)確反映腫瘤在體內(nèi)的真實(shí)生長(zhǎng)情況。

三維培養(yǎng)技術(shù)能夠很好地彌補(bǔ)二維培養(yǎng)的不足[4]。三維培養(yǎng)是指利用各種方法和材料，使細(xì)胞在空間上呈立體方式生長(zhǎng)，更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)狀況，形成類似于體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮其功能。與傳統(tǒng)的二維單層培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)為腫瘤細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)提供類似于體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境的生物支撐或基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞呈立體球狀生長(zhǎng)[5]。除此之外，在三維培養(yǎng)條件下，細(xì)胞與細(xì)胞或ECM間充分接觸并建立相互聯(lián)系[6]。研究表明，應(yīng)用三維培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的體外腫瘤模型與體內(nèi)腫瘤具有相似的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)特性[7]。本文擬對(duì)三維培養(yǎng)在婦科腫瘤研究中的應(yīng)用作一綜述，并展望其應(yīng)用前景及意義。

1 三維培養(yǎng)在卵巢癌研究中的應(yīng)用

1.1 腫瘤微環(huán)境對(duì)卵巢癌細(xì)胞影響的研究 Cai等[8]從卵巢囊腫患者的大網(wǎng)膜中和上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）轉(zhuǎn)移的大網(wǎng)膜中分離出原代人成纖維細(xì)胞，并分別與EOC細(xì)胞在體外建立三維共培養(yǎng)模型，用于研究大網(wǎng)膜成纖維細(xì)胞和EOC細(xì)胞之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未被癌細(xì)胞激活的成纖維細(xì)胞相比，大網(wǎng)膜中腫瘤細(xì)胞激活活化的成纖維細(xì)胞，即癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）形成一個(gè)適宜的環(huán)境，以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞植入大網(wǎng)膜，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，該三維培養(yǎng)模型提示大網(wǎng)膜中CAFs與卵巢癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Touboul等[9]從羊膜中提取間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC），并使用羊膜支架構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞和MSC的體外三維共培養(yǎng)模型，用以研究卵巢癌細(xì)胞和MSC之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MSC和卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，大多數(shù)腫瘤位于富含MSC的區(qū)域，在富含MSC的區(qū)域內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)更深，且在共培養(yǎng)條件下較高的白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）分泌可以增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲，在拮抗IL-6受體后，卵巢癌細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少（主要在富含MSC的區(qū)域中），表明MSC通過分泌IL-6促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示三維共培養(yǎng)模型為研究卵巢癌細(xì)胞浸潤(rùn)微環(huán)境提供較好模型。

1.2 卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為研究 體外研究發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 1，ROR1）和受體酪氨酸激酶樣孤兒受體 2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 2，ROR2）在卵巢癌轉(zhuǎn)移中起重要作用[10]，但是，當(dāng)使用二維培養(yǎng)模型來研究癌細(xì)胞的遷移時(shí)，不能研究間質(zhì)細(xì)胞參與的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。為了深入研究ROR1和ROR2在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的作用，Henry等[11]收集來源于女性良性或非轉(zhuǎn)移性婦科惡性腫瘤新鮮大網(wǎng)膜樣品中分離的原代成纖維細(xì)胞和間皮細(xì)胞，用膠原蛋白培養(yǎng)構(gòu)建器官型三維培養(yǎng)模型，并將ROR1、ROR2和雙ROR1/ROR2的穩(wěn)定短發(fā)夾RNA敲低的卵巢癌細(xì)胞接種到三維培養(yǎng)模型上以分析比較各組之間癌細(xì)胞黏附和侵襲能力的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)敲低卵巢癌細(xì)胞ROR1和ROR2基因強(qiáng)烈抑制癌細(xì)胞黏附和侵襲到大網(wǎng)膜模型，表明ROR1和ROR2聯(lián)合可明顯影響卵巢癌細(xì)胞向大網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)移。Henry等[12]還在卵巢癌相關(guān)基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了ROR2的上調(diào)，但沒有發(fā)現(xiàn)ROR1的上調(diào)，并且卵巢癌相關(guān)基質(zhì)中過表達(dá)的ROR2增加卵巢癌細(xì)胞的遷移，表明ROR2可能在間質(zhì)細(xì)胞參與的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起作用。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了使用復(fù)雜的器官型三維模型能夠更好地研究體外受體對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。由于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模型不能準(zhǔn)確再現(xiàn)人體大網(wǎng)膜的微環(huán)境，人們對(duì)早期卵巢癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制知之甚少，Kenny等[13]使用卵巢癌細(xì)胞和正常大網(wǎng)膜中分離的原代成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞、膠原等開發(fā)了一種模仿人體大網(wǎng)膜的器官型三維共培養(yǎng)模型，用以研究卵巢癌細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移，其結(jié)果顯示當(dāng)卵巢癌細(xì)胞黏附于大網(wǎng)膜時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）在卵巢癌細(xì)胞中被上調(diào)和水解活化，活化的MMP-2將ECM裂解為小片段，裂解的ECM片段隨后通過與其同源整聯(lián)蛋白受體結(jié)合而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞黏附和侵襲，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了三維培養(yǎng)模型對(duì)于研究早期卵巢癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。

1.3 抗卵巢癌藥物篩選研究 由于用于初級(jí)藥物篩選的傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)方法并不能很準(zhǔn)確地反映惡性腫瘤的自然進(jìn)展。Cha等[14]研究了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）1/2/3選擇性抑制劑BGJ398對(duì)單層培養(yǎng)和球形培養(yǎng)條件下的卵巢癌SKOV3ip1細(xì)胞的抗腫瘤活性，采用結(jié)晶紫染色試驗(yàn)檢測(cè)抑制劑處理前后的細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BGJ398處理48和72h的單層培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞中，細(xì)胞活力降低不明顯；而在球形培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞中，細(xì)胞活力明顯降低，且呈時(shí)間依賴性，表明腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)模型對(duì)于抗卵巢癌藥物篩選具有重要意義。Hirst等[15]在三維細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)了一組EOC細(xì)胞系，以形成多細(xì)胞腫瘤球體，并使用二維細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行對(duì)比篩選，以鑒定先前未鑒定出有抗腫瘤活性的抗癌藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)licofelone和glafenine在卵巢癌三維細(xì)胞培養(yǎng)物中具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是這些藥物僅用傳統(tǒng)的二維藥物篩選并未能鑒定出有抗腫瘤活性，提示使用體外球體三維藥物篩選模型對(duì)于抗卵巢癌藥物篩選具有重要作用。

2 三維培養(yǎng)在乳腺癌研究中的應(yīng)用

2.1 腫瘤微環(huán)境對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響研究 ECM相關(guān)黏附蛋白以及腫瘤基質(zhì)硬度是轉(zhuǎn)移的重要決定因素。由于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)不能考慮腫瘤微環(huán)境中的ECM硬度，因此當(dāng)研究ECM相關(guān)黏附蛋白（包括Ras抑制因子-1）在細(xì)胞侵襲方面與基質(zhì)硬度的關(guān)系時(shí)，不能使用傳統(tǒng)的二維單層培養(yǎng)物。Gkretsi等[16]采用增加濃度和硬度的三維膠原蛋白Ⅰ凝膠來嵌入不同侵襲性的乳腺癌細(xì)胞和腫瘤球狀體來研究ECM相關(guān)黏附蛋白與基質(zhì)硬度的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ras抑制因子-1在基質(zhì)硬度增加的條件下顯著上調(diào)；而由Ras抑制因子-1敲除的細(xì)胞形成的腫瘤球體在所有乳腺癌細(xì)胞系中以及不同基質(zhì)硬度條件下均喪失其侵襲能力，表明Ras抑制因子-1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。Daubriac等[17]開發(fā)了一種由乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、CAFs和膠原凝膠組成的三維共培養(yǎng)模型，用以研究CAFs和癌細(xì)胞之間的相互作用如何調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的侵襲性，結(jié)果顯示CAFs和乳腺癌細(xì)胞之間的相互作用增加了CAFs中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的分泌和癌細(xì)胞中纖溶酶原激活物抑制劑-1的活性，而胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和纖溶酶原激活物抑制劑-1均可激活癌細(xì)胞中的RhoA/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而增加癌細(xì)胞的擴(kuò)散和侵襲性。因此，三維共培養(yǎng)模型可明確CAFs調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞侵襲性的相關(guān)通路。

2.2 乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為研究 為了研究不同培養(yǎng)條件下DNA甲基化與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，Wang等[18]分別在二維和三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，并分析檢查乳腺癌細(xì)胞CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下乳腺癌細(xì)胞的DNA甲基化狀態(tài)無明顯差異，但是DNA甲基化異常與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。Toh等[19]開發(fā)了一種基于微流體的培養(yǎng)芯片，在該微流體芯片中，三維微環(huán)境被設(shè)計(jì)成在三維腫瘤模型中培養(yǎng)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞（MX-1），同時(shí)摻入化學(xué)引誘劑以刺激乳腺癌細(xì)胞穿過膜的運(yùn)動(dòng)性，并通過跟蹤系統(tǒng)中癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性來驗(yàn)證芯片的有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在微流體癌細(xì)胞遷移模型中，MX-1細(xì)胞能夠在45h內(nèi)穿過膠原屏障侵入側(cè)灌注通道，并能保持其細(xì)胞-細(xì)胞接觸做集體侵入運(yùn)動(dòng)，表明與傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞遷移的Boyden室相比，該系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞遷移，提示三維微流體培養(yǎng)芯片對(duì)于監(jiān)測(cè)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)具有重要意義。

2.3 抗乳腺癌藥物篩選研究 由于浸潤(rùn)性乳腺癌患者易對(duì)常規(guī)的化療藥物產(chǎn)生耐藥，Borges等[20]提出了一種新的治療策略，即將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱與蘇拉明相結(jié)合，在三維細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定蘇拉明、地西他濱和兩者的聯(lián)合治療對(duì)乳腺癌細(xì)胞的毒性反應(yīng)以及對(duì)細(xì)胞侵襲性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)條件下，單獨(dú)蘇拉明或地西他濱對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯的抑制和毒性反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞侵襲也沒有明顯的抑制作用，即使兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)亦無明顯的抑制作用，但能夠有效地阻止癌細(xì)胞侵入周圍的ECM，表明使用地西他濱和蘇拉明的聯(lián)合治療雖然無抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用，但明顯降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲潛力，提示蘇拉明和地西他濱聯(lián)合可用于治療侵襲性、多藥耐藥性乳腺癌。Hashemzehi等[21]在三維培養(yǎng)模型中評(píng)估了植物體包裹的姜黃素抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)模型中，隨著植物體姜黃素濃度增加，乳腺癌細(xì)胞的存活率和侵襲能力逐漸下降，尤其是乳腺癌細(xì)胞的侵襲力，提示植物體姜黃素以劑量依賴性方式抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)并且明顯降低其侵襲能力，表明植物體姜黃素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，為進(jìn)一步研究這種新型抗癌劑抗乳腺癌的作用提供試驗(yàn)依據(jù)。以上研究提示，三維培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于篩選治療乳腺癌的新型化療藥物或聯(lián)合化療方案均具有重要的意義。

3 三維培養(yǎng)在子宮內(nèi)膜癌研究中的應(yīng)用

3.1 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為研究 Grun等[22]使用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)法建立子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的三維培養(yǎng)模型，并與建立在二維培養(yǎng)中的相同細(xì)胞和原發(fā)性腫瘤的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞的二維單層培養(yǎng)物相比，三維多細(xì)胞球體呈簇狀生長(zhǎng)，類似于乳頭狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈多形性，細(xì)胞核增大，核仁明顯，還存在有絲分裂細(xì)胞；三維多細(xì)胞球體與具有子宮內(nèi)膜乳頭狀結(jié)構(gòu)的原發(fā)腫瘤具有相似的形態(tài)學(xué)特征，表明三維細(xì)胞系的生長(zhǎng)模式與原發(fā)腫瘤的形態(tài)學(xué)具有高度相似性，提示建立癌細(xì)胞系的三維培養(yǎng)模型對(duì)于研究子宮內(nèi)膜癌的生長(zhǎng)模式具有重要價(jià)值。Yamamoto等[23]采用三維培養(yǎng)方法研究子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系（Ishikawa，HEC1A和AN3CA）的形態(tài)和AF-6/afadin表達(dá)，使用Matrigel侵襲測(cè)定來證明AF-6/afadin敲低后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AF-6/afadin敲低導(dǎo)致三維細(xì)胞培養(yǎng)物中腺樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，提示AF-6/afadin的表達(dá)缺失可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲，但抑制腺體結(jié)構(gòu)的形成。以上研究表明，三維培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有力推動(dòng)了對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)行為的研究。

3.2 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性研究 晚期子宮內(nèi)膜癌患者常表現(xiàn)為對(duì)化療藥物的耐藥。Chitcholtan等[2]使用懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的三維多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并比較了多柔比星和順鉑在子宮內(nèi)膜癌三維多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和二維單層培養(yǎng)物中的抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多柔比星和順鉑在三維多細(xì)胞結(jié)構(gòu)中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡少于二維單層培養(yǎng)物，且三維多細(xì)胞培養(yǎng)物比細(xì)胞單層培養(yǎng)物具有更高的活力，表明與二維培養(yǎng)物相比，三維多細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)檢測(cè)化療藥物敏感性表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。

4 三維培養(yǎng)在宮頸癌研究中的應(yīng)用

Zhao等[24]使用宮頸癌Hela細(xì)胞、明膠、藻酸鹽、纖維蛋白原水凝膠為原料，并采用3D打印方法構(gòu)建宮頸癌體外培養(yǎng)模型。在宮頸癌3D打印模型中測(cè)量細(xì)胞增殖、MMP表達(dá)和化學(xué)抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與二維培養(yǎng)相比，3D打印模型中的Hela細(xì)胞顯示出更高的增殖速率、更高的MMP表達(dá)水平和更強(qiáng)的化療藥物的耐藥性，提示新的三維細(xì)胞打印技術(shù)可以促進(jìn)三維癌癥研究的發(fā)展。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，與二維單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，婦科惡性腫瘤細(xì)胞的三維立體培養(yǎng)模型與體內(nèi)腫瘤具有更為相似的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的真實(shí)情況。三維培養(yǎng)技術(shù)在研究婦科惡性腫瘤微環(huán)境、細(xì)胞生物學(xué)行為和篩選抗腫瘤藥物等方面具有重要意義。但三維培養(yǎng)技術(shù)仍然有些地方需要改進(jìn)，例如操作耗時(shí)長(zhǎng)、難以控制腫瘤球的大小和均一性等，尚需進(jìn)一步研究不斷完善，以滿足臨床研究。