□王嬌嬌 許錦秀 劉向玲 許彤（.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 河南 新鄉(xiāng) 453003；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 河南 新鄉(xiāng) 45300）

弱視是指視覺發(fā)育敏感期內(nèi)不正常的形覺體驗造成的視力障礙，Maya 等人研究發(fā)現(xiàn)成年弱視大鼠長期應(yīng)用氟西汀，可明顯逆轉(zhuǎn)眼優(yōu)勢柱轉(zhuǎn)移和促進(jìn)視功能恢復(fù)，但其作用機(jī)制不明，而這對成人弱視的治療至關(guān)重要。因此， 本研究以長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）為研究指標(biāo)，擬用電生理學(xué)方法探討5-羥色胺鹽酸鹽對單眼形覺剝奪性成年弱視大鼠離體腦片視皮層LTP 的影響，觀察5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）在成年弱視大鼠雙側(cè)視皮層神經(jīng)傳遞中的作用， 為臨床治療成人弱視提供一定理論依據(jù)。

1、材料和方法

1.1、材料

5-羥色胺鹽酸鹽（美國Sigma 公司）；LEICA VT 1000S 振動切片機(jī)（美國Leica 公司）；MODEL-97 拉直儀（美國Sutter Instrument 公司）；Micro1401 數(shù)模轉(zhuǎn)換器、Hum bug 電噪音消除器（英國Digitimer 有限公司）；PZMTIII-BS 精密立體變倍顯微鏡（美國WPI公司）；MINIPULS-3 蠕動泵（美國GILSON 公司）；Master-9 脈沖刺激器（以色列AMPI 公司）等。

1.2、方法

（1）實驗動物及分組。

2 周齡SD 大鼠16 只，標(biāo)準(zhǔn)清潔級，眼部無疾患，雌雄不限，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司， 隨機(jī)分為正常對照組（NC 組）和單眼形覺剝奪組（MD 組），每組8 只。單眼形覺剝奪組大鼠分別行右側(cè)眼瞼縫合術(shù)，術(shù)后飼養(yǎng)6 周(≥8 周齡)，處死2 組大鼠，制作視皮層腦組織切片孵育于人工腦脊液中。根據(jù)灌流人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中加入藥物的不同，將以上視皮層切片再細(xì)分為7 組：正常對照組（NC 組）、剝奪眼對側(cè)視皮層組（CC 組）和剝奪眼同側(cè)視皮層組（IC 組）均未加任何藥物，CCI 和ICI 組均加生理鹽水，CCII 和ICII 組均加5-羥色胺鹽酸鹽（10μmol/L）。以上實驗動物的飼養(yǎng)和使用均遵循由國家科學(xué)技術(shù)部頒布的《實驗動物管理條例》。

（2）切片腦脊液和人工腦脊液的配制。

參照文獻(xiàn)的方法配制切片腦脊液和ACSF， 所需試劑均購于美國Sigma 公司。

（3）大鼠視皮層腦組織切片的制備與孵育。

用10%水合氯醛（0.3-0.4ml/100g）對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，再用提前通氧（95%O2+5%CO2）且預(yù)冷（0℃）的切片腦脊液快速心臟灌注，斷頭取腦，將腦組織冠狀切割成厚度400μm 的腦組織切片，視皮層的形態(tài)辨別參考文獻(xiàn)， 將腦組織切片置于提前通混合氧≥30min 的ACSF 中，孵育1h 待用。

（4）離體腦組織切片視皮層LTP 的誘導(dǎo)。

將1 張腦組織切片置于記錄槽內(nèi)， 通有混合氧的ACSF（28℃-32℃）持續(xù)灌流入記錄槽，速度為3-4ml/min。參照文獻(xiàn)放置刺激電極和記錄電極。由Master-9 脈沖刺激器輸出刺激（波寬：50μs；頻率：0.1Hz），記錄基礎(chǔ)刺激之前先檢測刺激強(qiáng)度與神經(jīng)元場突觸后電位（field postsynaptic potential，fPSP）的關(guān)系，選取的最適刺激強(qiáng)度約為最大反應(yīng)（40-60）%所對應(yīng)的刺激強(qiáng)度，待fPSP 穩(wěn)定達(dá)10min，給予最適刺激強(qiáng)度的強(qiáng)直高頻刺激（high frequency stimulation，HFS，100Hz）誘導(dǎo)LTP，持續(xù)記錄1h。選取PSP 下行波振幅的10%和50%計算場突觸后電位斜率（fPSP slope），設(shè)定基礎(chǔ)刺激(10min)fPSP 斜率為100%，對HFS 后(51min-60min)fPSP 斜率的變化進(jìn)行分析。

（5）統(tǒng)計學(xué)分析。

（6）應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表達(dá)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小差異顯著法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1、HFS 誘導(dǎo)的正常對照組和單眼形覺剝奪組雙側(cè)視皮層LTP

HFS 后視皮層fPSP 斜率（%）變化：正常對照組為（198.1±13.5）%，剝奪眼同側(cè)視皮層組為（144.5±2.0）%， 剝奪眼對側(cè)視皮層組為（106.3±8.3）%，3 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=236.858，P＜0.001），且3 個組之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2、5-HT 對單眼形覺剝奪組大鼠雙側(cè)視皮層LTP 的影響

HFS 后剝奪眼對側(cè)視皮層fPSP 斜率(%)變化：生理鹽水處理組為（106.3±8.3）%，5-HT 處理組為（156.9±7.5）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-15.766，P＜0.001）；HFS 后剝奪眼同側(cè)視皮層fPSP 斜率(%)變化：生理鹽水處理組為（144.8±2.3）%，5-HT 處理組為（192.2±8.6）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-16.958，P＜0.001），且2 個5-HT 處理組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.367，P＜0.001）（圖2)。

圖1 HFS 誘導(dǎo)的正常大鼠和單眼形覺剝奪成年大鼠雙側(cè)視皮層fPSP斜率(%)變化

圖2 5-HT 對HFS 誘導(dǎo)的單眼形覺剝奪成年大鼠雙側(cè)視皮層fPSP斜率(%)的影響

3、討論

從胚胎時期視覺神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育就已開始并且持續(xù)至出生后，這一過程由不成熟逐漸發(fā)育至成熟狀態(tài)。大鼠視覺系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵期為出生后第14-45 天，成年期為出生后8-48 周。以往人們認(rèn)為視覺發(fā)育關(guān)鍵期結(jié)束，視皮層突觸可塑性消失，但隨著相關(guān)研究的深入，發(fā)現(xiàn)成年大鼠視皮層仍具有突觸可塑性。據(jù)此本實驗選擇出生后2 周齡未睜眼大鼠行右側(cè)眼瞼縫合術(shù)， 再飼養(yǎng)到至少8周齡，建立經(jīng)典的單眼形覺剝奪性成年弱視大鼠模型。

視皮層V1M 區(qū)稱為初級視皮層區(qū)， 而視皮層神經(jīng)回路有垂直連接和水平連接方式兩種方式。Li 等人研究發(fā)現(xiàn)，視皮層垂直連接神經(jīng)纖維較水平連接神經(jīng)纖維成熟的更慢， 表現(xiàn)出的突觸可塑性也較大。LTP 作為研究視皮層經(jīng)驗依賴眼優(yōu)勢可塑性的經(jīng)典指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶相關(guān)領(lǐng)域。既往誘導(dǎo)視皮層LTP 采用TBS刺激模式，由于成年大鼠視皮層突觸可塑性較幼年鼠下降，本實驗采用脈寬較小且頻率較高的HFS 誘導(dǎo)成年大鼠視皮層LTP。

Baroncelli 等人研究發(fā)現(xiàn)， 豐富環(huán)境可恢復(fù)成年弱視大鼠眼優(yōu)勢可塑性， 通過高效液相色譜分析法發(fā)現(xiàn)居于豐富環(huán)境的弱視大鼠視皮層5-HT 含量較正常環(huán)境大鼠含量升高，并且在哺乳動物的視網(wǎng)膜和視皮層也存在5-HT。因此，5-HT 與成年大鼠視皮層突觸可塑性有相關(guān)性，這也和我們的實驗結(jié)果5-HT 可提高成年弱視大鼠視皮層fPSP 斜率相吻合。

綜上所述，在新生大鼠睜眼之前行視覺剝奪至成年期，初級視皮層神經(jīng)元傳導(dǎo)神經(jīng)沖動的效率降低，突觸可塑性明顯下調(diào)，應(yīng)用5-HT， 可一定程度促進(jìn)視皮層神經(jīng)傳遞， 從而逆轉(zhuǎn)眼優(yōu)勢柱的轉(zhuǎn)移，這為成人弱視的治療提供了新的參考依據(jù)。